Pazopanib抑制劑

　　Pazopanib （GW786034） 是多靶點抑制劑，抑制 VEGFR1，VEGFR2，VEGFR3，PDGFRβ，c-Kit，FGFR1，c-Fms的IC50分別為10，30，47，84，74，140，146 nM。

 

 

 

　　體外研究

 

　　Pazopanib 顯示出對所有人類 VEGFR 受體的良好效力，對 VEGFR-1、-2 和-3 的 IC50 分別為 10、30 和 47 nM。還觀察到對密切相關的酪氨酸受體激酶 PDGFRβ、c-Kit、FGF-R1 和 c-fms 的顯著活性，IC50 分別為 84、74、140 和 146 nM。在細胞試驗中，除了抑制 VEGF 誘導的 HUVEC 增殖外，Pazopanib 還有效抑制 VEGF 誘導的 HUVEC 細胞中 VEGFR-2 的磷酸化，IC50 約為 8 nM。Pazopanib 在大鼠、狗和猴子中具有良好的藥代動力學，分別在 10、1 和 5 mg/kg 時具有低清除率 （1.4-1.7 mL/min/kg） 和良好的口服生物利用度 （72%、47%、65%）。除了 2C9 （7.9 μM） 外，細胞色素 P450 譜也得到改善，對測試的同工酶的抑制 >10 μM。

 

　　MCE尚未獨立證實這些方法的準確性。僅供參考。

 

　　體內研究

 

　　用 100 mg/kg 的 Pazopanib 處理小鼠，每天兩次，持續(xù) 5 天，導致血管形成程度的顯著抑制。使用 HT29 （結腸癌）、A375P （黑色素瘤） 和 HN5 （頭頸癌） 腫瘤后，在攜帶已建立的人異種移植物 （200?250 mm3） 的小鼠中檢查 Pazopanib 的抗血管生成活性標準的三周療程。與 A375P 模型相比，HN5 和 HT29 異種移植物在所有劑量下的反應都更好，A375P 模型歷來對 VEGFR-2 抑制劑具有更強的耐藥性。作為支持觀察到的異種移植物生長抑制是通過抗血管生成而非抗腫瘤機制發(fā)揮作用的證據，在低于 10 μM 的濃度下未觀察到 Pazopanib 對這些在含血清培養(yǎng)基中生長的人類腫瘤細胞系 （HT29、HN5、A375P） 的抗增殖活性。未觀察到對小鼠體重的顯著影響，并且在整個研究期間動物看起來健康且活躍。相關推薦：PP58是Src抑制劑

 

　　Pazopanib 滴眼液組粘附的白細胞數量低于未處理的糖尿病動物，高于健康動物。粘附在健康動物視網膜脈管系統上的平均白細胞為 37.2±7.8，而糖尿病動物的平均值為 102±15.6，比健康動物高約 3 倍。用 0.5 % w/v Pazopanib 混懸液處理的動物在其視網膜血管系統中粘附了 69.5±9.5 個白細胞，這明顯低于糖尿病動物。

 

　　MCE尚未獨立證實這些方法的準確性。僅供參考。

 

 

　　激酶試驗

 

　　采用純化的桿狀病毒表達谷胱甘肽- s-轉移酶（GST）融合蛋白編碼人類VEGFR受體激酶1、2或3的催化c端，在384孔微滴板上以均勻的時間分辨熒光（htf）格式進行VEGFR酶檢測。將10 μL活化的VEGFR2激酶溶液[終濃度，1 nM酶在0.1 M 4-（2-羥乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）中，pH為7.5，含0.1 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）， 300 μM二硫硫糖醇（DTT）]加入10 μL底物溶液[終濃度，360 nM肽，（生物素-氨基己基- eeeeyfelvakkkk - nh2）， 75 μM ATP, 10 μM MgCl2]和1 μL滴定化合物在DMSO中引起反應。室溫下孵育60 min，加入20 μL 100 mM乙二胺四乙酸（EDTA）猝滅反應。猝滅后，加入20 μL htf試劑（終濃度為15 nM鏈親素聯異藻藍蛋白，1 nM銪標記抗磷酸酪氨酸抗體，用0.1 mg/mL BSA稀釋，0.1 M HEPES, pH 7.5），孵育至少10 min。用Wallac Victor板讀板儀測量665 nM處的熒光，延時50 μs。

 

 

　　細胞試驗

 

　　使用市售試劑盒，采用5-溴-2-脫氧尿苷（BrdU）摻入法測定Pazopanib對細胞增殖的影響。HUVEC在含有5%胎牛血清（FBS）的培養(yǎng)基中接種于1型膠原包被的96孔板中，在37°C, 5% CO2條件下孵育過夜。從細胞中抽吸培養(yǎng)基，在無血清培養(yǎng)基中加入不同濃度的Pazopanib到每孔中。30min后，在孔中加入VEGF （10 ng/mL）或bFGF （0.3 ng/mL）。細胞再孵育72 h，在孵育的最后18 ~ 24 h加入BrdU （10 μM）。在孵育結束時，用ELISA檢測BrdU在細胞中的摻入情況。數據用方程描述的曲線擬合，y=Vmax（1?（x/（K+x））），其中K等于IC50。

 

　　MCE尚未獨立證實這些方法的準確性。僅供參考。

 

　　動物實驗方法

 

　　小鼠

 

　　在8 ~ 12周齡裸鼠體內注射腫瘤細胞懸液誘發(fā)腫瘤。當腫瘤體積達到100 ~ 200 mm3時，將小鼠隨機分為8組。帕唑帕尼每天給藥1次或2次，劑量分別為10、30或100 mg/kg。在研究結束時，動物被吸入二氧化碳安樂死。腫瘤體積每周用卡尺測量兩次，使用公式：腫瘤體積（mm3）=（length×width2）/2。結果通常報告為%抑制率=1?（藥物處理群體的平均增長/載體處理對照群體的平均增長）。

 

　　大鼠

 

　　雄性棕色-挪威（BN;體重200至250 g的色素大鼠在任何實驗程序之前至少適應兩天。禁食12-16小時后，腹腔注射鏈脲佐菌素溶液30 mg/mL，加入10 mM檸檬酸緩沖液（pH 4.5） （60 mg/kg體重）誘導糖尿病。注射鏈脲佐菌素后3 ~ 4 h，飼喂常規(guī)飼料，注射后24 h，尾靜脈采血（5 ~ 10 μL）。動物的血糖水平是用血糖監(jiān)測器測定的。血糖水平超過250毫克/分升的動物被認為是糖尿病。這些動物被分成三組。組1:健康（n=12），組2:糖尿�。╪=12），組3:糖尿病+治療（n=12）。糖尿病誘導后立即開始治療。用0.5% w/v Pazopanib混懸液（每只眼10 μL體積）每天給藥2次，連續(xù)30天，各組動物于第31天、第30天末次給藥后16-17 h處死。

 

　　MCE尚未獨立證實這些方法的準確性。僅供參考。