牙囊干細胞的細胞外小泡為牙周組織再生提供生化線索

文獻信息

近日，昆明醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院云南口腔醫(yī)學重點實驗室、昆明醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院正畸科團隊的研究成果“Small extracellular vesicles from dental follicle stem cells provide biochemical cues for periodontal tissue regeneration（牙囊干細胞的細胞外小泡為牙周組織再生提供生化線索 ）在雜志Stem Cell Research & Therapy（IF：6.832 ）上發(fā)表。平生公司的離活一體Micro CT（NEMO）在論文中提供了重要的大鼠牙周組織圖像。

該研究的共同通訊作者為胡江天、楊禾豐，共同第一作者為馬麗婭、饒南荃。

文獻摘要

背景：基于干細胞衍生的細胞外小囊泡（SEV）療法已被探索作為牙周再生干細胞移植療法的替代方案。牙囊干細胞（DFSCs）在再生醫(yī)學中具有巨大的應用潛力。然而，目前尚不清楚DFSC衍生的SEV（DFSCs-SEV）是否可用于牙周再生。本研究旨在探討DFSCs-sEVs能否再生受損的牙周組織及其潛在的機制。

方法：分離鑒定DFSCs-sEVs，并將其與牙周膜干細胞（PDLSCs）共培養(yǎng)。使用EdU分析、CCK-8分析、細胞周期分析、劃痕實驗、茜素紅染色、qRT-PCR和western blot分析，檢測DFSCs-sEVs對PDLSCs生物學行為的影響。RNA測序和功能富集分析用于檢測DFSCs-sEVs對PDLSCs影響的信號通路。用ERK1/2或p38 MAPK抑制劑預處理PDLSC，以研究ERK1/2和p38 MAPK通路參與的可能性。此外，將DFSCs-sEVs與膠原海綿復合移植到SD大鼠牙周組織缺損處，然后用蘇木精-伊紅（HE）染色和Micro CT檢查牙周組織的病理變化。

結果：PDLSCs可內(nèi)化DFSCs-sEVs，從而通過EdU分析、CCK-8分析和細胞周期分析促進細胞增殖。DFSCs-SEV顯著增強了PDLSC的遷移。DFSCs-sEVs促進PDLSC的成骨分化，顯示出深茜素紅染色、成骨基因上調(diào)（RUNX2，BSP，COL1）和蛋白表達上調(diào)（RUNX2，BSP，COL1，ALP）。作者發(fā)現(xiàn)DFSCs-sEVs激活了p38 MAPK信號通路。特異性抑制劑（SB202190）對該信號通路的抑制部分削弱了被DFSCs-sEVs增強的增殖能力。DFSCs-sEVs移植后，大鼠牙周損傷區(qū)可見新的牙周膜樣結構和骨形成。在新形成的牙周膜和缺損區(qū)軟組織中觀察到標記的DFSCs-SEV。

結論：作者的研究表明，DFSCs-sEVs通過促進PDLSC的增殖、遷移和成骨分化，促進牙周組織再生。

實驗方法

大鼠牙周缺損模型

本研究共使用72只12周齡雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠。允許動物自由獲取水和食物，并將其保存在受控環(huán)境中（50%濕度、25°C和12小時的明暗循環(huán)）。所有動物隨機分為3組：空白組（未治療，n=24）；膠原蛋白海綿組（CS，n=24）；膠原海綿組負載DFSCs-sEVs（CS-sEVs，n=24）。如前所述，在大鼠第一磨牙的牙周組織上造成牙周缺損（3×2×1 mm）。按照各組對大鼠進行治療，并在術后2周、4周和8周采集下頜骨樣本。

Micro CT分析

收集的樣本用4%多聚甲醛固定24小時。接下來，使用Micro CT系統(tǒng)（NEMO，NMC-100，中國昆山平生醫(yī)療有限公司）進行采集。使用以下參數(shù)掃描下頜下磨牙區(qū)域：90 kV電壓和60μA電流。重建數(shù)據(jù)，并使用Avatar 1.5.0軟件（PINGSENG Healthcare Inc.）分析缺損區(qū)域的骨體積/組織體積（BV/TV）比和小梁厚度（Tb.Th）。

實驗結果

Micro CT結果顯示，三組移植后2周未見牙周膜樣組織和新骨形成，移植后4周可見新骨形成。移植4周后，膠原海綿組形成分散的新骨碎片，而DFSCs-sEVs組觀察到彌漫性骨形成，與其他2組相比，DFSCs-sEVs組觀察到更密集的新骨形成（圖7D）。此外，作者發(fā)現(xiàn)DFSC-sEVs組在術后2周的小梁厚度明顯高于未治療組（圖7E）。此外，三組移植后2、4、8周，DFSCs-sEVs組牙骨質與新骨之間均有不同程度的牙周膜樣組織。間隔4周后，與其他兩組相比，DFSCs-sEVs組顯示出高度細胞化的牙周組織，細胞垂直于牙骨質和牙槽骨，呈現(xiàn)出最多的愈合跡象，這與Micro CT結果一致。未治療組和膠原海綿組均有結締組織形成。然而，沒有一種膠原纖維具有條紋，這些條紋是牙周膜的一個顯著特征，有序排列并嵌入牙骨質之間，覆蓋牙根和牙槽骨窩內(nèi)壁（圖7F）。為了探討DFSCs-SEV的定位和存活，將PKH26標記的DFSCs-SEV移植到大鼠牙周缺損區(qū)。移植2周后，在新形成的牙周膜和缺損區(qū)軟組織中觀察到標記的DFSCs-SEV，而移植4周后觀察到標記較少的DFSCs-SEV（圖7B，C）。這表明DFSCs-sEVs參與了大鼠缺損牙周組織中新的牙周膜樣組織和新骨的形成。

DFSCs-sEVs促進大鼠牙周組織再生。A體內(nèi)實驗設計。B DFSC-SEV的體內(nèi)定位。細胞核用DAPI（藍色）染色，DFSC-SEV用PKH26（紅色）標記。白色箭頭顯示DFSCs-SEV。C DFSC-SEV的量化。D具有代表性的顯微CT重建圖像顯示2-8周時不同組的新骨形成。定量微CT評估BV/TV（%）、Tb。Th（毫米）。F牙周再生的組織學評價。CS，膠原海綿；nb，新骨；nPDL，新牙周膜；d：牙本質*p＜0.05,**p<0.01

文獻結論

在本研究中，DFSCs-sEVs通過促進PDLSCs的增殖、遷移和成骨分化，促進大鼠缺損牙周組織中新的牙周膜樣結構和新骨的形成；這些生理過程可能部分歸因于p38 MAPK信號通路的激活。作者的發(fā)現(xiàn)為牙周組織再生中無細胞治療策略的發(fā)展提供了實驗基礎。

使用設備

Micro CT（型號：NEMO）（平生醫(yī)療科技）

影像軟件：Avatar（平生醫(yī)療科技）