In-gel熒光檢測技術(shù)的介紹及其在泛素化蛋白互作中的應(yīng)用

常規(guī)的蛋白質(zhì)分析實(shí)驗(yàn)中，在電泳分離結(jié)束后，還需進(jìn)行蛋白染色、轉(zhuǎn)膜、western blot 等一系列鑒定步驟。In-gel熒光檢測技術(shù)，突破常規(guī)，在電泳分離后即可進(jìn)行蛋白檢測，無需染色和western blot等后續(xù)操作。由于免去了凝膠電泳后的一系列操作，不僅大幅縮減了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，有效提升效率并降低試劑耗材等實(shí)驗(yàn)成本，同時(shí)還能消除轉(zhuǎn)膜、封閉過程中眾多因素的影響。

In-gel熒光檢測的技術(shù)原理在于：在凝膠中，蛋白結(jié)合復(fù)合物的遷移率與未結(jié)合的蛋白不同，可被分離開來。使用熒光基團(tuán)標(biāo)記其中一種蛋白，樣品中該蛋白及其結(jié)合復(fù)合物的條帶均可被檢測出來。電泳結(jié)束后，使用成像設(shè)備（如Azure多功能分子成像系統(tǒng)、Sapphire FL激光掃描成像系統(tǒng)）進(jìn)行成像檢測。目前，In-gel熒光檢測在融合蛋白表達(dá)、蛋白互作分析、凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)等方面已具有廣泛的應(yīng)用。

— 實(shí)驗(yàn)案例：泛素化蛋白互作 —
基于In-gel熒光檢測方法，對(duì)泛素化相關(guān)過程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。將熒光標(biāo)記的泛素（Fluorescently labeled ubiquitin，以下簡稱為FL-Ub）與E1 泛素激活酶（以下簡稱為E1）和E2 泛素連接酶（以下簡稱為E2）孵育后進(jìn)行凝膠電泳分離，并使用Azure 600 多功能分子成像系統(tǒng)進(jìn)行成像檢測。

方法
熒光標(biāo)記的FL-Ub與E1、E2 蛋白孵育結(jié)合，通過加入非變性SDS緩沖液，分別在0.5、1、2、4、8、16、30、和60min后淬火結(jié)合反應(yīng)。在非變性條件下進(jìn)行電泳，每個(gè)泳道FL-Ub上樣量約200ng。

電泳結(jié)束后，進(jìn)行In-gel熒光檢測：使用Azure 600多功能分子成像系統(tǒng)的 EPI 藍(lán)光光源（472nm激發(fā)，513nm采集）進(jìn)行成像，即可檢測FL-Ub及其復(fù)合物。

結(jié)果
In-gel熒光檢測圖像中，可見游離的FL-Ub條帶，同時(shí)顯示，F(xiàn)L-Ub+E1、FL-Ub+E2復(fù)合物的量均隨反應(yīng)時(shí)間的增加而增加（圖 1）。
 

結(jié)論
In-gel熒光檢測，通過熒光標(biāo)記蛋白，無需染色和Western Blot，即可實(shí)現(xiàn)蛋白互作的可視化分析，顯著提升了實(shí)驗(yàn)效率、有效降低試劑耗材等方面成本。

Azure多功能分子成像系統(tǒng)、Sapphire FL激光掃描成像系統(tǒng)為代表的尖端熒光分子成科技，除In-gel熒光檢測功能外，其在各類Blots、凝膠、磷屏、微陣列（芯片）、培養(yǎng)皿、活體成像、組織切片等多領(lǐng)域，均具有廣泛靈活的應(yīng)用，將持續(xù)為卓越分子成像呈獻(xiàn)更多可能！