小鼠模型在助力發(fā)現(xiàn)癌細胞借助神經(jīng)來對抗饑餓療法研究中的應用

為了對付癌癥，科學家在上世紀70年代就提出了著名的“饑餓療法”，即通過抑制腫瘤生長所需的血管生成，阻斷其獲得氧氣和養(yǎng)分，從而最終“餓死”腫瘤。盡管這種療法能夠?qū)Χ喾N癌癥產(chǎn)生強烈的抗腫瘤作用，但令人驚訝的是，癌細胞可以利用腫瘤微環(huán)境（TME）在營養(yǎng)不良的環(huán)境中茁壯成長。

神經(jīng)也是TME中不可或缺的細胞成分。人們普遍認為，外周神經(jīng)（包括交感神經(jīng)、副交感神經(jīng)和感覺神經(jīng)）參與了TME的構(gòu)建，可調(diào)控癌癥發(fā)生和進展。有趣的是，一項最新研究發(fā)現(xiàn)，一種依賴于外源性絲氨酸的胰腺癌細胞亞型可利用神經(jīng)來供應絲氨酸，表明癌癥相關(guān)神經(jīng)與TME中的癌癥代謝存在著廣泛的聯(lián)系，但這種聯(lián)系在很大程度上還不為人所知。

上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院口腔頜面-頭頸腫瘤科季彤/王旭/孫樹洋領(lǐng)導的研究團隊近日在《Cell Metabolism》雜志上發(fā)表論文，首次揭示了癌細胞能夠利用傷害性感覺神經(jīng)（nociceptive nerves）在營養(yǎng)不良的環(huán)境中生長，而破壞癌細胞與傷害性感覺神經(jīng)之間的相互作用可以有效提高饑餓療法的抗腫瘤效果。
 

《Cell Metabolism》（https://doi.org/10.1016/j.cmet.2022.10.012）

研究材料與方法
此次研究以口腔鱗狀細胞癌（OSCC）為模型，對100多名患者的樣本開展了分析。研究者還利用OSCC細胞系Cal27和黑色素瘤細胞系B16F10構(gòu)建了小鼠舌異種移植模型。在分析CGRP蛋白的作用時，研究人員使用了賽業(yè)生物提供的Calca^flox/flox和Rosa26^Calca/Calca小鼠。他們利用不同的AAV載體在舌黏膜的傷害性感覺神經(jīng)中表達轉(zhuǎn)基因，并通過高劑量的辣椒素來進行去神經(jīng)化處理。研究者還使用了PET-CT成像、3D培養(yǎng)和轉(zhuǎn)錄組測序等方法。

技術(shù)路線
01通過小鼠舌異種移植模型，發(fā)現(xiàn)癌癥相關(guān)的傷害性感覺神經(jīng)促進腫瘤生長
02體外和體內(nèi)實驗表明，傷害性感覺神經(jīng)介導的促生長作用依賴于低糖環(huán)境
03信號阻斷和siRNA等實驗表明，神經(jīng)源性CGRP在低糖環(huán)境下介導了傷害性感覺神經(jīng)對癌細胞的生長促進作用
04神經(jīng)源性CGRP在癌細胞中誘導保護性自噬，而自噬依賴于Rap1-GTPase信號通路的激活
05通過Rimegepant破壞癌細胞與傷害性感覺神經(jīng)之間的相互作用，可增強營養(yǎng)饑餓療法的效果

研究結(jié)果
1.傷害性感覺神經(jīng)在低糖環(huán)境下促進癌細胞生長
口腔鱗狀細胞癌的特征之一是患者報告疼痛和神經(jīng)周圍浸潤（PNI）發(fā)生率較高。研究人員在分析小鼠腫瘤和人類患者后發(fā)現(xiàn)，OSCC中存在高密度的TRPV1+傷害性感覺神經(jīng)。降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）通常可作為傷害性感覺活動的分子指標。他們發(fā)現(xiàn)，CGRP在OSCC組織的癌癥相關(guān)傷害性感覺神經(jīng)中被檢測到，而且CGRP+傷害性感覺神經(jīng)比例較高的患者總生存率較低，提示傷害性感覺神經(jīng)在OSCC進展中起作用。

為了進一步研究傷害性感覺神經(jīng)在癌癥進展中的作用，研究人員在小鼠的舌粘膜下層分別了接種了人類OSCC細胞系Cal27和黑色素瘤細胞系B16F10，以建立小鼠舌異種移植模型。所有移植物都檢測到了神經(jīng)生態(tài)位和高比例的CGRP+神經(jīng)。小鼠血漿中的鼠類CGRP從第8天開始緩慢增加，這表明小鼠的傷害性感覺活動升高。在使用高劑量的辣椒素削弱傷害性感覺神經(jīng)后，Cal27和B16F10腫瘤均變小了，表明癌癥相關(guān)的傷害性感覺神經(jīng)有助于腫瘤生長。

接著，研究人員探討了傷害性感覺神經(jīng)如何促進腫瘤生長。在小鼠舌異種移植模型中，腫瘤組織中葡萄糖含量的下降幅度比鄰近的正常組織明顯更大，表明腫瘤在口腔黏膜中快速消耗葡萄糖。同時，舌異種移植物中的應激反應蛋白和糖酵解酶水平更高，表明高的糖酵解活性可能促成了OSCC腫瘤的低糖環(huán)境。

在低糖條件下，三叉神經(jīng)節(jié)條件培養(yǎng)基（TG CM）的培養(yǎng)促進了腫瘤細胞的生長。研究人員利用Cal27細胞開展體外實驗，表明在低糖環(huán)境下，傷害性感覺神經(jīng)會促進癌細胞增殖。之后，研究者在小鼠身上開展實驗，采用30%的葡萄糖水迫使異種移植瘤中的葡萄糖含量升高。研究者發(fā)現(xiàn)，腫瘤內(nèi)葡萄糖含量的增加逆轉(zhuǎn)了去除傷害性感覺神經(jīng)介導的抗生長作用。這些體外和體內(nèi)實驗表明，傷害性感覺神經(jīng)介導的促生長作用依賴于低糖環(huán)境。

2.神經(jīng)源性CGRP介導了傷害性感覺神經(jīng)的促生長作用
神經(jīng)可釋放多種分子來調(diào)節(jié)TME，包括代謝物、神經(jīng)肽和核酸。研究人員推測，培養(yǎng)基中的分泌型活性蛋白介導了傷害性感覺神經(jīng)的促生長作用。于是，他們使用Rimegepant（CGRP受體拮抗劑）來阻斷CGRP信號，發(fā)現(xiàn)TG CM介導的細胞生長被顯著抑制。同時，通過siRNA敲低CGRP結(jié)合蛋白（CLR或RAMP1）也能達到類似的效果，表明體外傷害性感覺神經(jīng)對癌細胞的生長促進作用部分源于神經(jīng)源性CGRP。

體內(nèi)實驗進一步證實了這些結(jié)果。研究者利用Calca^flox/flox和Rosa26^Calca/Calca小鼠（由賽業(yè)生物提供）開展的實驗表明，在條件性敲除舌黏膜傷害性感覺神經(jīng)中的Calca（CGRP編碼基因）后，B16F10舌異種移植物的生長受到顯著抑制。這些結(jié)果表明，神經(jīng)源性CGRP在低糖環(huán)境下介導了傷害性感覺神經(jīng)對癌細胞的生長促進作用。
 

神經(jīng)源性CGRP介導了傷害性感覺神經(jīng)對癌細胞的生長促進作用^[1]

研究人員進一步分析后發(fā)現(xiàn)，在與高CGRP神經(jīng)生態(tài)位鄰近的腫瘤區(qū)域，Ki67+癌細胞比例更高。腫瘤組織中CALCA水平較高的患者的總生存期和無病生存期較差。與健康供體相比，OSCC患者的術(shù)前血漿CGRP水平明顯更高。此外，在人類OSCC組織中，CLR和RAMP1都在癌癥相關(guān)神經(jīng)生態(tài)位周圍的癌細胞中表達。由此可見，神經(jīng)源性CGRP及其受體CLR在OSCC進展過程中異常升高，并與患者結(jié)局較差相關(guān)。

3.神經(jīng)源性CGRP誘導癌細胞的保護性自噬
為了深入了解神經(jīng)源性CGRP在低糖環(huán)境下的作用機制，研究人員比較了在高糖和低糖培養(yǎng)條件下的Cal27細胞的轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)僅在低糖培養(yǎng)條件下表達變化的基因與多條自噬途徑顯著相關(guān)。在低糖培養(yǎng)條件下和2-DG處理后，采用rhCGRP處理Cal27細胞會提高LC3B-II水平，并降低p62水平，且細胞中的自溶酶體和自噬體數(shù)量上調(diào)。同樣地，TG CM可顯著誘導OSCC PDE癌細胞的自噬通量，而Rimegepant可拮抗自噬通量。這些結(jié)果表明在低糖環(huán)境中，傷害性感覺神經(jīng)通過神經(jīng)源性CGRP誘導癌細胞的保護性自噬。后續(xù)的分析發(fā)現(xiàn)，CGRP誘導的細胞保護性自噬依賴于Rap1-GTPase信號通路的激活。Rap1激活通過破壞mTOR與Raptor的相互作用而抑制mTOR的磷酸化。

4.在低糖環(huán)境下，癌細胞利用傷害性感覺神經(jīng)產(chǎn)生CGRP
接下來，研究團隊又反過來思考：癌細胞如何影響TME中的傷害性感覺神經(jīng)？研究者發(fā)現(xiàn)，與癌細胞共培養(yǎng)會導致三叉神經(jīng)節(jié)中的Calca水平升高，而對癌細胞進行低糖培養(yǎng)和2-DG預處理會導致Calca水平明顯升高，表明低糖環(huán)境會在某種程度上增加癌細胞對傷害性感覺神經(jīng)的影響。進一步分析發(fā)現(xiàn)，在低糖條件下，癌細胞通過上調(diào)神經(jīng)生長因子NGF的表達來促進傷害性感覺神經(jīng)分泌CGRP，而癌細胞分泌NGF依賴JNK-c-Jun通路。體內(nèi)實驗也證明了這一點，癌細胞在低糖環(huán)境下利用傷害性感覺神經(jīng)產(chǎn)生CGRP。

5.破壞癌細胞與傷害性感覺神經(jīng)之間的相互作用

破壞癌細胞與傷害性感覺神經(jīng)的互作可增強饑餓療法的抗腫瘤效果^[1]

研究人員推測，破壞癌細胞與傷害性感覺神經(jīng)之間的相互作用可增強營養(yǎng)饑餓療法的效果。他們發(fā)現(xiàn)，糖酵解抑制劑（2-DG、Lonidamine）和血管生成抑制劑（Anlotinib和Bevacizumab）這兩類饑餓療法會加劇癌細胞與傷害性感覺神經(jīng)之間的惡性循環(huán)。不過在與Rimegepant（CGRP受體拮抗劑）聯(lián)合使用后，饑餓療法的抗腫瘤效果可有效提高。Rimegepant目前已在國內(nèi)外上市，可用于偏頭痛的治療和預防。

研究結(jié)論

癌細胞在營養(yǎng)不良的環(huán)境中生長的機制示意圖^[1]

總的來說，這項研究發(fā)現(xiàn)，缺乏營養(yǎng)的環(huán)境啟動了癌細胞與傷害性感覺神經(jīng)之間的惡性循環(huán)。癌細胞產(chǎn)生的神經(jīng)生長因子利用傷害性感覺神經(jīng)產(chǎn)生CGRP，進而促進癌細胞的保護性自噬。利用一種獲批上市的偏頭痛藥物來阻斷神經(jīng)源性CGRP，可以顯著提高饑餓療法的治療效果。

原文檢索：
[1]Zhang et al., Cancer cells co-opt nociceptive nerves to thrive in nutrient-poor environments and upon nutrient-starvation therapies, Cell Metabolism (2022), https://doi.org/10.1016/j.cmet.2022.10.012