高密度微載體灌流工具助力Vero細胞高密度灌流培養(yǎng)及消化轉移工藝驗證
Vero細胞是生物醫(yī)藥領域中制備病毒載體和疫苗最常用的細胞系，基于微載體的灌流培養(yǎng)工藝是較為常用的生產(chǎn)方式，對較高微載體投放濃度條件下灌流工藝的建立必不可缺。
本文主要利用高密度微載體灌流工具在較小體積的CloudReady™云平臺生物反應器上進行Vero細胞高密度灌流培養(yǎng)及消化轉移工藝的探索，建立縮小模型。
方法與結果
使用CloudReady™（500 mL）云平臺生物反應器（圖1）和自行設計的灌流裝置完成Vero細胞在Cytodex 1 微載體上的高密度灌流培養(yǎng)。
攪拌槳葉使用多葉槳（低剪切力），攪拌方向為上揚式。
灌流工具安裝于反應器內(nèi)部，通過管路與外部進、出液瓶連接。
圖1 CloudReady™云平臺生物反應器
實驗工藝參數(shù)設置如表1所示。
溫度由半導體Peltier模塊的加熱和制冷實現(xiàn)無水控溫。
DO由空氣和氧氣的通氣速率級聯(lián)控制。
pH由二氧化碳的通氣速率和堿液（0.5 M NaOH）的流加速率級聯(lián)控制。其中，進氣模式均為底部通氣。在完整的培養(yǎng)周期中，各參數(shù)控制均可靠且穩(wěn)定（圖2）。
圖2 培養(yǎng)過程中溫度、pH、DO參數(shù)控制穩(wěn)定性
Day 3時開始以2VVD的灌流速度進行灌流，在Day 8即灌流培養(yǎng)5天后細胞密度達到7.82×106cells/mL，微載體上細胞密度變化如圖3所示。
圖3 微載體上細胞密度變化曲線
由每天取樣鏡檢圖像（圖4）可見，Day 1-2時細胞在微載體上貼附較為均勻，Day 3-5細胞快速增殖鋪板滿微載體表面，空球率低，Day 6-8細胞在微載體上生長至較滿的狀態(tài)。整個培養(yǎng)過程中灌流裝置未出現(xiàn)堵塞現(xiàn)象，細胞增殖13倍。
在培養(yǎng)結束時，使用胰蛋白酶-EDTA (0.25%) 進行消化，細胞收率64%，活率100%，將收獲所得細胞重新接種到原微載體上進行批次培養(yǎng)，細胞貼壁及增殖性能正常（圖4）。
圖4 每24 h及消化轉移取樣鏡檢圖
本實驗證實了該高密度灌流培養(yǎng)及逐級消化轉移工藝可行性較高，為后續(xù)更高微載體投放密度及逐級放大工藝的建立提供了縮小模型的數(shù)據(jù)基礎，也為實際規(guī)模化生產(chǎn)過程中種子細胞的批量制備提供了可嘗試的方法。
圖5 CloudReady™云平臺生物反應器
CloudReady™云平臺生物反應器（圖5）應用靈活，可實現(xiàn)各類貼壁或懸浮細胞高密度培養(yǎng)，進行批次、補料、灌流等多種生物工藝的開發(fā)和優(yōu)化，在較小體系中迅速建立工藝流程，助力研發(fā)效率飛速提升。
