免疫組化IHC實(shí)驗(yàn)流程介紹
免疫組織化學(xué)技術(shù)或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)IHC (immunocytochemistry) 是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理——抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素) 顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原 (多肽和蛋白質(zhì))，對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究。它是組織化學(xué)的分支，它是用標(biāo)記的特異性抗體 (或抗原) 對(duì)組織內(nèi)抗原 (或抗體) 的分布進(jìn)行組織和細(xì)胞原位檢測(cè)技術(shù)。
免疫組化的標(biāo)本主要是組織標(biāo)本和細(xì)胞標(biāo)本兩大類(lèi)。組織標(biāo)本中包括石蠟切片（標(biāo)本制作的 shou 選方法）和冰凍切片。一般而言，石蠟切片要求薄厚均勻，切片完整，且無(wú)褶無(wú)刀痕，相當(dāng)考驗(yàn)實(shí)驗(yàn)人員的刀工，建議找專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)過(guò)的人員或公司進(jìn)行切片。
1、脫蠟與水化：將石蠟切片放置于 60°烤箱烤片 30-60 min，這一步是為了使蠟片水分蒸發(fā)和石蠟融化，好讓組織切片牢固地貼在玻片上。而后依次將其放入二甲 benI、II、III 各 10 min，乙醇梯度（高至低：100%、95%、80%、70%）各 2 min，水洗 5 min（不要直接對(duì)著切片沖洗）。PBS 洗 3 次，3 min/次。
2、細(xì)胞通透與封閉：用預(yù)熱的封閉通透液（40 ml PBS+120ul TritonX-100+400ul 30%H2O2）浸潤(rùn)切片 30 min（RT 避光），降低內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。PBS 洗 3 次，3 min/次。
3、抗原修復(fù)：由于制作石蠟切片時(shí)，甲醛固定使得蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用從而失去抗原性，這一步就是讓胞內(nèi)的抗原決定簇重新「滿血復(fù)活」。
小魚(yú)常用的是微波修復(fù)，pH 6.0 的 0.01M 檸檬酸鈉緩沖液浸泡切片，在微波爐里高火 4 min 至沸騰后，取出自然冷卻至室溫，重復(fù) 2 次，每次補(bǔ)足液體以免干片。（當(dāng)然有的朋友用酶修復(fù)法也是可以的）。PBS 洗 3 次，3 min/次。
4、血清封閉：用與二抗同一來(lái)源的血清封閉一些非特異性結(jié)合位點(diǎn)。此時(shí)可用「zhu 傳」的油性筆圍繞組織畫(huà)圈，并對(duì)圈內(nèi)的組織滴加稀釋好的血清，37℃ 溫箱中 30 min, 用濾紙吸去多余的血清。
5、孵育一抗：對(duì)圈內(nèi)的組織（面積為 1×1）滴加稀釋好的一抗 20ul，4℃ 過(guò)夜或者 37℃ 1-2 h。PBS 洗 3 次，3 min/次。（一般 4℃ 過(guò)夜后，需要將切片放置 37℃ 復(fù)溫 45 min，防止脫片以及可使抗原抗體結(jié)合的更穩(wěn)定）
6、孵育二抗：對(duì)圈內(nèi)的組織（面積為 1×1）滴加稀釋好的二抗 20ul，37℃ 1-2 h，PBS 洗 3 次，3 min/次。
7、切片顯色：用 DAB-H2O2 顯色 10 min，顯色液最好是現(xiàn)用現(xiàn)配，此時(shí)要通過(guò)顯微鏡觀察染色是否明顯，10 min 內(nèi)即可用蒸餾水終止顯色。
8、復(fù)染及封片：為了形成細(xì)胞輪廓，更好的定位目標(biāo)蛋白，可用 Mayer 蘇木素染色 30s，水洗，鹽酸酒精分化 2s，流水浸入 15 min。脫水時(shí)，乙醇梯度（由低至高：50%、70%、95%、100%）各 2 min。二甲 ben 5 min 使切片透明化，最后加入中性樹(shù)膠封片（一般封片后最好立即拍照，若不能及時(shí)拍照，可用指甲油封固并保持好避光和濕度）。
免疫組化的標(biāo)本主要是組織標(biāo)本和細(xì)胞標(biāo)本兩大類(lèi)。組織標(biāo)本中包括石蠟切片（標(biāo)本制作的 shou 選方法）和冰凍切片。一般而言，石蠟切片要求薄厚均勻，切片完整，且無(wú)褶無(wú)刀痕，相當(dāng)考驗(yàn)實(shí)驗(yàn)人員的刀工，建議找專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)過(guò)的人員或公司進(jìn)行切片。
1、脫蠟與水化：將石蠟切片放置于 60°烤箱烤片 30-60 min，這一步是為了使蠟片水分蒸發(fā)和石蠟融化，好讓組織切片牢固地貼在玻片上。而后依次將其放入二甲 benI、II、III 各 10 min，乙醇梯度（高至低：100%、95%、80%、70%）各 2 min，水洗 5 min（不要直接對(duì)著切片沖洗）。PBS 洗 3 次，3 min/次。
2、細(xì)胞通透與封閉：用預(yù)熱的封閉通透液（40 ml PBS+120ul TritonX-100+400ul 30%H2O2）浸潤(rùn)切片 30 min（RT 避光），降低內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。PBS 洗 3 次，3 min/次。
3、抗原修復(fù)：由于制作石蠟切片時(shí)，甲醛固定使得蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用從而失去抗原性，這一步就是讓胞內(nèi)的抗原決定簇重新「滿血復(fù)活」。
小魚(yú)常用的是微波修復(fù)，pH 6.0 的 0.01M 檸檬酸鈉緩沖液浸泡切片，在微波爐里高火 4 min 至沸騰后，取出自然冷卻至室溫，重復(fù) 2 次，每次補(bǔ)足液體以免干片。（當(dāng)然有的朋友用酶修復(fù)法也是可以的）。PBS 洗 3 次，3 min/次。
4、血清封閉：用與二抗同一來(lái)源的血清封閉一些非特異性結(jié)合位點(diǎn)。此時(shí)可用「zhu 傳」的油性筆圍繞組織畫(huà)圈，并對(duì)圈內(nèi)的組織滴加稀釋好的血清，37℃ 溫箱中 30 min, 用濾紙吸去多余的血清。
5、孵育一抗：對(duì)圈內(nèi)的組織（面積為 1×1）滴加稀釋好的一抗 20ul，4℃ 過(guò)夜或者 37℃ 1-2 h。PBS 洗 3 次，3 min/次。（一般 4℃ 過(guò)夜后，需要將切片放置 37℃ 復(fù)溫 45 min，防止脫片以及可使抗原抗體結(jié)合的更穩(wěn)定）
6、孵育二抗：對(duì)圈內(nèi)的組織（面積為 1×1）滴加稀釋好的二抗 20ul，37℃ 1-2 h，PBS 洗 3 次，3 min/次。
7、切片顯色：用 DAB-H2O2 顯色 10 min，顯色液最好是現(xiàn)用現(xiàn)配，此時(shí)要通過(guò)顯微鏡觀察染色是否明顯，10 min 內(nèi)即可用蒸餾水終止顯色。
8、復(fù)染及封片：為了形成細(xì)胞輪廓，更好的定位目標(biāo)蛋白，可用 Mayer 蘇木素染色 30s，水洗，鹽酸酒精分化 2s，流水浸入 15 min。脫水時(shí)，乙醇梯度（由低至高：50%、70%、95%、100%）各 2 min。二甲 ben 5 min 使切片透明化，最后加入中性樹(shù)膠封片（一般封片后最好立即拍照，若不能及時(shí)拍照，可用指甲油封固并保持好避光和濕度）。
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