微小型生物反應器在高密度培養(yǎng)293T細胞中的應用

293T細胞被廣泛應用于瞬時轉(zhuǎn)染以過表達各種重組蛋白或病毒包裝，其優(yōu)點包括高轉(zhuǎn)染效率、低成本的放大性和人糖基化模式^[1]。隨著基因治療和細胞治療的飛速發(fā)展，293T細胞越來越多地應用于腺相關病毒（adeno-associated virus，AAV）載體，重組腺相關病毒（recombinant adeno-associated virus，rAAV）載體及慢病毒的生產(chǎn)^[2]。為實現(xiàn)更大規(guī)模的GMP生產(chǎn)要求以滿足基因治療、細胞治療領域相關研發(fā)和臨床實驗，越來越多的研究人員將目光轉(zhuǎn)向了生物反應器工藝。

從培養(yǎng)箱到生物反應器工藝過程中，有三大挑戰(zhàn)。首先，293T原本是貼壁細胞屬性，需要貼附在載體表面進行生長。目前最常用的貼壁載體為Cytodex1球狀載體，如Vero細胞在這個體系下細胞密度可達到1.0×10⁷ cells/mL以上。但293T細胞的貼壁牢固性較Vero細胞這類貼壁細胞弱，在微載體攪拌的過程中會導致細胞的脫落和死亡，因此在生產(chǎn)應用中仍有所限制。其次，貼壁的293T細胞在生長過程中需要添加血清等動物源成分，影響了后期的質(zhì)量控制。最后，貼壁細胞在逐級放大過程中受到細胞消化效率的限制。面對這些挑戰(zhàn)，有研究人員將293T細胞馴化成無血清懸浮細胞株，解決了以上問題，但細胞密度只能在10⁶ cells/mL水平^[3]。

生物反應器作為大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)的有利工具，已經(jīng)被應用到293T懸浮培養(yǎng)工藝中。然而通常的批次模式下，營養(yǎng)成分的耗竭及代謝副產(chǎn)物的積累往往限制細胞生長及代謝，流加（Fed-batch）培養(yǎng)工藝因其操作簡單、過程放大容易、重復性高等優(yōu)點已成為動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的主流模式。因此我們用293T 懸浮細胞在CloudReady™ 500mL生物反應器系統(tǒng)上進行了Fed-batch 培養(yǎng)，為293T懸浮細胞高密度表達提供參考（圖1），為病毒載體生產(chǎn)工藝提供新的可行性。
 

圖1 CloudReady™ 500mL生物反應器系統(tǒng)

操作過程

本次實驗以5×10⁵ cells/mL的細胞密度接種，將空氣和氧氣級聯(lián)DO，CO₂ 和 0.5 mol/L NaOH溶液級聯(lián)pH。其他參數(shù)控制和補料控制見表1和表2。另外，在第八天根據(jù)細胞實際情況又額外補加了10mL 293瞬轉(zhuǎn)表達用補料A和1mL 293瞬轉(zhuǎn)表達用補料B。

表1 工藝控制參數(shù)設定

 

結(jié)果

本次實驗進行了長達217h的培養(yǎng)周期，經(jīng)過上述條件的控制，最終細胞密度達到了2.28×10⁷ cells/mL，并且活率維持在93%以上（圖2）。實驗過程中沒有通入0.5 mol/L NaOH溶液，pH最低值維持在6.7以上（圖3）。根據(jù)CARE（迪必爾生物應用技術(shù)與工程研究中心）前期培養(yǎng)293T細胞的經(jīng)驗，pH控制在6.9-7.3，會造成大量的乳酸積累，培養(yǎng)期間持續(xù)增加至4.41g/L^[4]

此次實驗通過降低了pH設定值，乳酸濃度最大不超過2g/L，最后穩(wěn)定在1.5g/L左右（圖4）。這樣的結(jié)果給下一步利用微小型平行生物反應器進行工藝優(yōu)化提供了一定的參考。
 

圖2 239T細胞培養(yǎng)過程增殖曲線,“Fed”指補加293瞬轉(zhuǎn)表達用補料A和B兩種培養(yǎng)基。


圖3 293T細胞培養(yǎng)周期參數(shù)控制趨勢圖：紅色-溫度；黑色-pH;綠色-DO；黃色-轉(zhuǎn)速（rpm）；藍色-CO₂流速（mL/min）；灰色-空氣流速（mL/min）；橙色-氧氣流速（mL/min）。


圖4 239T細胞培養(yǎng)過程葡萄糖消耗曲線和乳酸鹽代謝曲線。

參考文獻

[1]. DEKEVIC G, TASTO L, CZERMAK P, et al. Statistical experimental designs to optimize the transient transfection of HEK 293T cells and determine a transfer criterion from adherent cells to larger-scale cell suspension cultures [J]. J Biotechnol, 2022, 346: 23-34.

[2]. ABAANDOU L, QUAN D, SHILOACH J. Affecting HEK293 Cell Growth and Production Performance by Modifying the Expression of Specific Genes [J]. Cells, 2021, 10(7).

[3]. TANG Q, GU L, WU H, et al. Establishing 293T suspension cultrue for lentiviral vector production in a stirred bioreactor [J]. 2020.

[4]. 汪興. HEK 293T細胞在一次性生物反應器（3L）的懸浮培養(yǎng)工藝. 迪必爾生物工程（上海）有限公司. 2023

CloudReady™云平臺生物反應器（圖5）整合了多種補料策略，同時內(nèi)置DoE實驗設計與分析軟件可以幫助用戶快速地進行布局實驗，縮短產(chǎn)品的開發(fā)周期。

圖5 CloudReady™ 第6代平行生物反應器