Nature子刊:基于油凝膠脂肪替代物構建可食用微載體
衍生的微組織而開發(fā)的培養(yǎng)肉平臺
細胞培養(yǎng)肉是指通過動物細胞體外培養(yǎng)生產的肉類產品,是近年來興起的細胞生物學和組織工程等學科交叉的新領域。細胞培養(yǎng)肉的技術核心基于動物細胞的增殖能力,在體外大規(guī)模培養(yǎng)動物細胞獲得肌肉、脂肪等組織,再經食品化加工生產得到肉類食品。細胞培養(yǎng)肉的開發(fā)旨在解決傳統(tǒng)畜牧業(yè)空間和能源耗費巨大、不環(huán)保的弊端,降低對環(huán)境的影響,提高動物福利,并為世界日益增長的人口提供可用的蛋白質來源。國內部分政策中可以看出未來可能會有相關監(jiān)管條例動向:2021年12月24日,農業(yè)農村部印發(fā)的《“十四五”全國農業(yè)農村科技發(fā)展規(guī)劃》,也首次提到將細胞培養(yǎng)肉納入到下一個五年規(guī)劃當中;2022年5月10日,國家發(fā)改委發(fā)布《“十四五”生物經濟發(fā)展規(guī)劃》中提出的發(fā)展合成生物學技術,探索研發(fā)“人造蛋白”等新型食品,實現(xiàn)食品工業(yè)迭代升級,降低傳統(tǒng)養(yǎng)殖業(yè)帶來的環(huán)境資源壓力。
2023年5月23日,以色列理工學院研究人員在期刊Nature Communications(IF: 17.694)發(fā)表了題為“Cultured meat platform developed through the structuring of edible microcarrier-derived microtissues with oleogel-based fat substitute”的研究論文。本研究證明了利用Applikon MiniBio生物反應器在可食用微載體上生產細胞微組織,經過聚集或均質加工生成的細胞塊,被進一步嵌入油凝膠脂肪替代物,產生培養(yǎng)肉(CM)原型。
動物源性肉類中的脂肪成分對肉制品的味道、口感和質地有很大作用,為了模擬CM中脂肪的這些特性,專家學者開發(fā)開發(fā)了一種脂肪替代物(FS),利用植物油和凝膠劑制備固體結構化的油凝膠來替代肉制品中的動物脂肪。對于基于油凝膠的FS生產,這里使用基于油凝膠的水包油乳液模板的方法。生產基于油凝膠的基質的第一步是產生由蛋白質穩(wěn)定的水包油凝膠乳液,油凝膠液滴致密且緊密堆積,平均尺寸為1-3μm,用單硬脂酸甘油酯(GMS)構建油滴顆粒,然后進行凍干(圖5a)。
研究人員展示了一種開發(fā)CM產品的新方法,由可食用微載體和油凝膠脂肪替代物組成的CM平臺(圖1)。優(yōu)化了牛骨髓間充質干細胞在可食用殼聚糖-膠原微載體上的擴增,獲得細胞微組織;同時,開發(fā)了一種含有植物蛋白的油凝膠系統(tǒng)作為脂肪替代物,其外觀和質地可與牛肉脂肪相媲美。研究者們結合細胞化微組織和開發(fā)的脂肪替代物,介紹了兩種類型的培養(yǎng)肉原型:分層式培養(yǎng)肉和漢堡式培養(yǎng)肉。分層的原型有利于增強硬度,而漢堡樣的原型具有大理石花紋肉樣的外觀和柔軟的質地?傮w而言,該平臺及其建立的技術基礎有助于不同培養(yǎng)肉產品的開發(fā),并促進其商品化生產。
圖1 培養(yǎng)肉平臺示意圖
牛原代間充質干細胞bMSCs在可食用微載體上的擴增培養(yǎng)
(1)細胞接種?墒秤梦⑤d體以每cm2表面積8000-10000個細胞的密度接種,37℃培養(yǎng)。孵育24 h后,用FDA(活細胞)和PI(死細胞)染色種子微載體,熒光顯微鏡觀察附著細胞及其在微載體上的均勻分布。
(2)細胞擴增。使用Applikon MiniBio生物反應器(500mL)進行動態(tài)培養(yǎng)。將種子細胞微載體與200mL培養(yǎng)基轉移到生物反應器中,溫度37℃,pH 7.2,DO 100%,進氣速度1mL/min泵入空氣,為整個培養(yǎng)體系提供氣源。軟件自動調節(jié)生物反應器的溫度、pH和DO等參數(shù),使其在整個培養(yǎng)過程中處于設定值。
為實現(xiàn)bMSCs在生物反應器中的規(guī);瘮U增,優(yōu)化了以下條件:通氣方式、攪拌速度和補料策略(圖2):
a.通氣方式:
底部通氣效果不佳,會產生泡沫,擾亂了微載體的正常懸浮狀態(tài)。而頂通方式泵入空氣,氣體覆蓋反應器罐體頂部空間,促進氧氣擴散到培養(yǎng)基中而沒有任何負面影響,因此選用頂通進行下一步(圖2a)。
b.攪拌速度:
比較了攪拌速度從45rpm逐漸增加到70rpm和從60rpm逐漸增加至80rpm兩種方案(圖2b)。較低的攪拌速度雖然可以使細胞獲得充足的營養(yǎng)和通氣,但從細胞活力來看(圖2c),它未能充分懸浮微載體,會積聚在罐底并形成聚集體(圖2d)。較高的攪拌速度可以充分懸浮微載體,同時支撐細胞生長(圖2a,b)。
c.補料策略:
優(yōu)化了新鮮培養(yǎng)基添加時間,在培養(yǎng)第3、5和7天更換50%的培養(yǎng)基可以使細胞獲得充足的營養(yǎng),并及時降低代謝廢物濃度。
圖2 生物反應器培養(yǎng)參數(shù)的優(yōu)化。(a)生物反應器通氣方式的優(yōu)化;(b)生物反應器攪拌速度的優(yōu)化;(c)使用45rpm至70rpm攪拌速度時,微載體上活/死細胞的成像。綠色:活細胞;紅色:死亡細胞。比例:100μm;(d)以45rpm至70rpm的攪拌速度培養(yǎng)時,生物反應器底部形成的聚集體(箭頭)。
使用優(yōu)化后的參數(shù)在生物反應器中動態(tài)培養(yǎng),細胞更均勻。培養(yǎng)8天后收獲細胞微載體,免疫熒光染色研究bMSCs表面標志物的表達,其特異性表面標記物對CD29和CD44呈陽性,對CD45呈陰性,為進一步驗證這些結果,使用流式細胞術得到了相同的免疫表型(圖3)。特異的bMSC表面標志物在擴增后仍保持不變,表明基于微載體的擴增培養(yǎng)沒有誘導干細胞發(fā)生變化。
圖3 bMSC在生物反應器中擴增8天后的免疫表型特征
采用先進的加工方法,以產生的微組織衍生聚集體(圖4)、油凝膠脂肪替代物(圖5)和轉谷氨酰胺酶(TG)交聯(lián)為基礎,進一步整合構建出兩種CM原型(圖6a)。此外,研究顯示,在生物反應器中培養(yǎng)時,bMSCs可成功地粘附在可食用的殼聚糖-膠原微載體上并增殖,且生長動力學曲線與實驗室規(guī)模的培養(yǎng)相當,為未來大規(guī)模工業(yè)化生產提供了可行性的證明。
Applikon MiniBio生物反應器可用于干細胞擴增,并能夠將剪切力和傳質系數(shù)轉化為工業(yè)規(guī)模生物反應器。一般來說,生物反應器中的動態(tài)攪拌有助于氧氣和營養(yǎng)物質的均勻分布并混合,從而適合更大的容器和均勻的條件。對于工業(yè)規(guī)模化生產來說,整個培養(yǎng)的同質性對于保證產品的可復制性和標準化具有重要意義。從研究結果中也可以看出,在擴增8天后微載體上的細胞得到高效的增殖意味著其規(guī);虡I(yè)生產的可行性。
圖4 微組織衍生的聚集體
圖5 脂肪替代物的生產和表征
圖6 培養(yǎng)肉模型的結構和特征
近些年,頭部細胞培養(yǎng)肉公司的投入重點已逐漸從實驗室走向規(guī)模化,目前中國市場也有部分企業(yè)在培養(yǎng)肉領域獲得了一些關鍵性技術突破,其中中試規(guī)模工廠從數(shù)量及產能上均有擴張趨勢。細胞培養(yǎng)工藝過程的精準優(yōu)化、高效放大等,是細胞培養(yǎng)肉規(guī)模化生產的核心技術,使用精準的小型生物反應器系統(tǒng)有助于早期工藝開發(fā)階段進行篩選、優(yōu)化培養(yǎng)基、建模等相關研究。小型反應器具有操作簡單、通量高、成本低等優(yōu)勢,能夠較大程度提升工藝開發(fā)的效率,降低研發(fā)成本和縮短開發(fā)周期。
參考文獻
◀ 原文鏈接:https://www.nature.com/articles/s41467-023-38593-4
◀ Yen FC, Glusac J, Levi S, Zernov A, Baruch L, Davidovich-Pinhas M, Fishman A, Machluf M. Cultured meat platform developed through the structuring of edible microcarrier-derived microtissues with oleogel-based fat substitute. Nat Commun. 2023 May 23;14(1):2942. doi: 10.1038/s41467-023-38593-4. PMID: 37221160; PMCID: PMC10205709.
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