超色差校準(zhǔn)物鏡在腦組織四色免疫熒光分析中的應(yīng)用

簡介

使用熒光染料標(biāo)記生物組分，然后利用光學(xué)顯微鏡（如共聚焦顯微鏡）獲取熒光圖像的方法，已成為觀察生物組織和細(xì)胞分子定位的常用實(shí)驗(yàn)方法。

然而，由于顯微物鏡中透鏡組造成的光學(xué)色差，常會導(dǎo)致難以使用紫外光和近紅外區(qū)域中的熒光染料，在同一標(biāo)本中精確顯示不同組分在細(xì)胞內(nèi)的準(zhǔn)確的共定位關(guān)系。使用EVIDENT超色差校準(zhǔn)物鏡PLAPON60XOSC，即使熒光標(biāo)記橫跨紫外和近紅外區(qū)域，也能以幾乎沒有色差的方式準(zhǔn)確顯示熒光標(biāo)記分子定位情況。下面介紹在單個標(biāo)本中使用四種類型熒光抗體，仍然可以準(zhǔn)確可視化熒光標(biāo)記分子的共定位分析的案例。

超色差校準(zhǔn)物鏡的應(yīng)用-腦組織的四色免疫熒光

腦組織的四色免疫熒光：圖（1）

VIAAT染色（Alexa Fluor405，藍(lán)色）

CB1染色（Alexa Fluor488，綠色）

VGluT3染色（Cy3，紅色）

腦組織的四色免疫熒光：圖（2）

VIAAT染色（Alexa Fluor405，藍(lán)色）

CB1染色（Alexa Fluor488，綠色）

VIP染色（Cy3，紅色）

GABAergic籃狀細(xì)胞有兩種表達(dá)大麻素受體CB1并控制錐體細(xì)胞胞體的亞型，一種亞型表達(dá)膽囊收縮素（CCK），另一種表達(dá)血管活性腸肽（VIP）。這種四色免疫熒光染色顯示，在高表達(dá)CB1（綠色）和VIAAT（藍(lán)色）的陽性神經(jīng)末梢（紅色）周圍缺乏DGLα（白色），這表明VIP陽性神經(jīng)末梢不參與侵入性突觸的形成。比例尺：5 μm。

FV3000

• 配有常規(guī)掃描單元的FV3000或配有常規(guī)/共振混合掃描單元的FV3000RS

• 可在所有通道進(jìn)行高效、準(zhǔn)確的全真光譜檢測

• 可針對活細(xì)胞進(jìn)行優(yōu)化的高靈敏度和低光毒性成像

• 可根據(jù)各種應(yīng)用和樣品類型靈活選擇倒置和正置機(jī)身

這種超色差校準(zhǔn)物鏡可校正大范圍的色差，采集的圖像可以準(zhǔn)確反應(yīng)熒光信號定位。它可大幅度校正2D和3D圖像中的橫向和軸向色差，從而為共定位分析帶來可靠性和準(zhǔn)確度。

• 大限度補(bǔ)償色差

• 每一個物鏡都附帶實(shí)測色差數(shù)據(jù)，405 nm到650 nm之間的軸向色差小于0.1 μm

• 適合嚴(yán)格共定位分析或超分辨率成像

結(jié)論：

如圖（1）和（2）所示，針對多種功能分子和細(xì)胞標(biāo)志物的四色免疫熒光提供有關(guān)細(xì)胞表達(dá)和亞細(xì)胞定位的詳細(xì)信息，其中包括相關(guān)功能細(xì)胞與細(xì)胞間空間距離的相互依賴或獨(dú)立關(guān)系。更為重要的是，顯微鏡的檢測靈敏度和分辨率，以及能夠盡可能減小色差的物鏡光學(xué)性能是實(shí)現(xiàn)免疫熒光目標(biāo)的重要因素。

doi：10.1523/JNEUROSCI.4681-14.2015。

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