剪切力調控Glypican-4在內皮功能中的表達及對動脈粥樣硬化的臨床意義
動脈粥樣硬化的特征主要表現為血管內層（內膜）出現脂質沉積、炎癥反應、細胞增生等改變，形成斑塊。通過與細胞外基質分子（尤其是蛋白聚糖）相互作用，致動脈粥樣硬化脂蛋白在內皮下基質中的沉積被認為是關鍵的潛在機制。在病理條件下，脂蛋白會發(fā)生氧化、糖化、水解和硫酸化等改變，從而促進炎癥并增強動脈粥樣硬化生成過程。
動脈粥樣硬化斑塊的形成常發(fā)生在動脈分叉處，此時血流模式為湍流，產生不均勻的剪切應力。粥樣斑塊的區(qū)域的湍流模式會引起炎癥反應增加，這反過來似乎增加了斑塊破裂的可能性。因此，動脈粥樣硬化易發(fā)區(qū)域的內皮細胞（ECs）表達更高水平的炎癥觸發(fā)因子，從而使斑塊的不穩(wěn)定性增加，導致斑塊破裂或斑塊侵蝕。
血管ECs的管腔表面被糖萼覆蓋，糖萼是1-5μm厚的細胞外層，由糖胺聚糖、蛋白聚糖和糖蛋白組成。完整的糖萼被認為具有動脈粥樣硬化保護作用。硫酸乙酰肝素（HS）是表面糖萼層的糖胺聚糖成分，具有許多可能影響動脈粥樣硬化生成的功能。在心血管ECs的糖萼中發(fā)現的主要硫酸肝素蛋白聚糖（HSPGs）主要包括位于細胞膜表面的磷脂酰肌醇蛋白多糖家族（glypicans，GPCs）和多配體蛋白多糖家族（syndecans，SDCs）以及位于細胞外基質中的基膜蛋白多糖（perlecan/HSPG2）。其中，SDC1或SDC4缺失可促進動脈粥樣硬化斑塊的形成，即使在通常受層流保護的區(qū)域也是如此。然而，迄今為止只研究了有限數量的蛋白聚糖。特別是，glypican-4（GPC4）的作用尚不清楚。GPC4作為一種脂肪因子調節(jié)胰島素受體信號傳導，因此可能與肥胖和心血管疾病相關，但尚不清楚內皮細胞GPC4的表達是否在動脈粥樣硬化形成中起作用。
最近，德國埃爾朗根-紐倫堡大學醫(yī)學院心臟病學和心血管學系、紐倫堡總醫(yī)院血管及腔內血管外科及加拿大阿爾伯塔大學公共衛(wèi)生學院的一項聯合研究假設內皮細胞GPC4的表達通過調節(jié)內皮活化和免疫細胞粘附在動脈粥樣硬化發(fā)生中發(fā)揮作用。相關內容發(fā)表在 International Journal of Molecular Sciences 期刊題為“The Shear Stress-Regulated Expression of Glypican-4 in Endothelial Dysfunction In Vitro and Its Clinical Significance in Atherosclerosis”。
首先，實驗使用流式細胞術確認了GPC4在人臍動脈內皮細胞（HUAECs）和人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）中表達，而且無論孵育時間或樣本性別如何，HUVECs中的GPC4表達均高于HUAECs。然后在有或沒有腫瘤壞死因子（TNF）-α刺激的HUVECs和HUVECs中，分別觀察第0天和第7天mRNA的表達水平。大多數分析的基因（總共26個基因）對TNF-α刺激沒有反應，GPC4 表達不受TNF-α刺激的影響，尤其是在HUVECs 中。分析表明，GPC4表達可能與膽固醇轉運相關基因的差異表達相關，無論是在第7天還是在第0天以及有與沒有TNF-α刺激的條件下。
接下來，將 HUVECs 暴露于流動刺激中 1 天或 10 天（10.2-10.8 dyne/cm²，即高剪切應力、層流模式；2.5-3.5 dyne/cm²，即低剪切應力、不均勻的流動模式），并使用免疫細胞化學染色觀察 GPC4 和 HS（圖1 A）。在初步實驗中，HUAECs和HUVECs之間GPC4和HS的表達沒有差異，因此，僅使用HUVECs進行動態(tài)流動實驗。結果觀察到免疫標記的GPC4和HS在層流區(qū)和湍流區(qū)在1天后的熒光強度呈正相關，在10天后減弱。
在1天和10天的流動刺激后，GPC4在非均勻流區(qū)的表達較層流區(qū)顯著降低（圖1 B，左）。GPC4的表達隨流動時間的延長總體呈下降趨勢。在層流和非均勻剪切應力區(qū)域，1天后HS的校正細胞總熒光有顯著差異，但在10天后無差異（圖1 B，右）。此外，觀察到HS表達模式的流動依賴性差異，在1天的流動之后，層流區(qū)域觀察到網狀模式，在非均勻剪切應力區(qū)域存在連續(xù)中斷，而10天后，兩個區(qū)域的模式都被破壞（圖1 C）。這說明GPC4的表達受剪切應力的調控。
在1天或10天的流動暴露后，用TNF-α刺激HUVECs，并量化THP-1細胞的粘附。在兩個暴露期，與非均勻剪切應力區(qū)相比，層流區(qū)域的THP-1粘附細胞數量顯著降低。非均勻區(qū)THP-1細胞粘附數量在10天后比1天后有增加的趨勢。
為了研究內皮GPC4是否在THP-1細胞粘附中起作用，通過siRNA轉染在HUVECs中敲低GPC4，并進行粘附測定。轉染GPC4 siRNA的HUVECs在層流和非均勻剪切應力區(qū)THP-1細胞粘附顯著高于轉染對照 siRNA的HUVECs，而VCAM-1和E-selectin的表達無顯著差異。用HS降解酶肝素酶III處理可降低HUVECs中的HS，但對THP-1單核細胞粘附無影響。此外，肝素酶III處理對GPC4 siRNA轉染的ECs對THP-1細胞粘附沒有額外的影響。
進一步地，實驗還分析了GPC4在體外表達中的可能的性別差異。雖然在靜態(tài)條件下培養(yǎng)的ECs的FACS分析中未觀察到性別差異，但發(fā)現，在層流和非均勻剪切應力區(qū)域的流動條件下，與男性樣本相比，女性的GPC4蛋白表達往往更高。此外，層流和非均勻剪切應力區(qū)域之間的差異在女性中比在男性中更明顯。然而，在HS的表達或THP-1細胞的粘附方面，男性和女性之間沒有發(fā)現顯著差異。
此外，還分析了糖萼成分在人類動脈粥樣硬化病變中的分布。GPC4、HS和 SDC4 的表達百分比在炎癥較重的PS中低于炎癥較輕的PS（圖2）。相關性分析表明，SDC4與HS的表達在重度和輕度炎癥的PS中均呈正相關，GPC4和HS之間以及GPC4和SDC4在炎癥較輕的PS中也觀察到這些正相關的趨勢。此外，HS與GPC4、HS與SDC4的表達也呈顯著正相關。
圖2 GPC4、HS和SDC4在所有斑塊切片（plaque sections，PS）中的表達。
最后，實驗將所有斑塊切片分為脆弱、穩(wěn)定或初始斑塊部分。初始斑塊切片顯示糖萼分子都沒有顯著差異。在穩(wěn)定斑塊切片中，SDC4和HS在炎癥程度較高和較低的PS區(qū)域的表達差異有統(tǒng)計學意義，而在GPC4中未達到統(tǒng)計學意義。在脆弱的斑塊切片中，與炎癥較輕的PS相比，炎癥較重的PS中GPC4明顯降低，而HS受影響較小。SDC4無顯著差異。
還比較了不同斑塊類型炎癥程度較高的PS中糖萼分子的表達模式。與脆弱斑塊和穩(wěn)定斑塊相比，GPC4和HS在初始斑塊中表達最高，而SDC4在這些斑塊類型中表達無差異（圖3 A、B）。有趣的是，僅在脆弱的斑塊切片中觀察到糖萼分子與炎癥程度較高的PS中CD68表達決定的局部炎癥呈強烈負相關，而在初始斑塊或穩(wěn)定斑塊切片中則沒有觀察到。這說明，糖萼成分的內皮表達取決于斑塊易損性和局部炎癥。
圖3 GPC4 （A）和HS（B）在不同斑塊類型切片中的表達比較。
該研究在體外和體內證明了不同糖萼分子在內皮細胞中表達的特點。動態(tài)粘附測定顯示，GPC4在動脈粥樣硬化發(fā)生的早期階段通過減弱免疫細胞對EC的早期粘附而具有潛在作用。GPC4和HS在人動脈粥樣硬化病變中的獨特表達突出了對炎癥和斑塊易損性的影響。雖然需要進一步的研究來闡明不同的機制，但上述數據表明內皮糖萼在心血管疾病中的臨床意義。
參考文獻：Urschel K, Hug KP, Zuo H, Büttner M, Furtmair R, Kuehn C, Stumpfe FM, Botos B, Achenbach S, Yuan Y, Dietel B, Tauchi M. The Shear Stress-Regulated Expression of Glypican-4 in Endothelial Dysfunction In Vitro and Its Clinical Significance in Atherosclerosis. Int J Mol Sci. 2023 Jul 18;24(14):11595. doi: 10.3390/ijms241411595. PMID: 37511353; PMCID: PMC10380765.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37511353/
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動脈粥樣硬化斑塊的形成常發(fā)生在動脈分叉處，此時血流模式為湍流，產生不均勻的剪切應力。粥樣斑塊的區(qū)域的湍流模式會引起炎癥反應增加，這反過來似乎增加了斑塊破裂的可能性。因此，動脈粥樣硬化易發(fā)區(qū)域的內皮細胞（ECs）表達更高水平的炎癥觸發(fā)因子，從而使斑塊的不穩(wěn)定性增加，導致斑塊破裂或斑塊侵蝕。
血管ECs的管腔表面被糖萼覆蓋，糖萼是1-5μm厚的細胞外層，由糖胺聚糖、蛋白聚糖和糖蛋白組成。完整的糖萼被認為具有動脈粥樣硬化保護作用。硫酸乙酰肝素（HS）是表面糖萼層的糖胺聚糖成分，具有許多可能影響動脈粥樣硬化生成的功能。在心血管ECs的糖萼中發(fā)現的主要硫酸肝素蛋白聚糖（HSPGs）主要包括位于細胞膜表面的磷脂酰肌醇蛋白多糖家族（glypicans，GPCs）和多配體蛋白多糖家族（syndecans，SDCs）以及位于細胞外基質中的基膜蛋白多糖（perlecan/HSPG2）。其中，SDC1或SDC4缺失可促進動脈粥樣硬化斑塊的形成，即使在通常受層流保護的區(qū)域也是如此。然而，迄今為止只研究了有限數量的蛋白聚糖。特別是，glypican-4（GPC4）的作用尚不清楚。GPC4作為一種脂肪因子調節(jié)胰島素受體信號傳導，因此可能與肥胖和心血管疾病相關，但尚不清楚內皮細胞GPC4的表達是否在動脈粥樣硬化形成中起作用。
最近，德國埃爾朗根-紐倫堡大學醫(yī)學院心臟病學和心血管學系、紐倫堡總醫(yī)院血管及腔內血管外科及加拿大阿爾伯塔大學公共衛(wèi)生學院的一項聯合研究假設內皮細胞GPC4的表達通過調節(jié)內皮活化和免疫細胞粘附在動脈粥樣硬化發(fā)生中發(fā)揮作用。相關內容發(fā)表在 International Journal of Molecular Sciences 期刊題為“The Shear Stress-Regulated Expression of Glypican-4 in Endothelial Dysfunction In Vitro and Its Clinical Significance in Atherosclerosis”。
首先，實驗使用流式細胞術確認了GPC4在人臍動脈內皮細胞（HUAECs）和人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）中表達，而且無論孵育時間或樣本性別如何，HUVECs中的GPC4表達均高于HUAECs。然后在有或沒有腫瘤壞死因子（TNF）-α刺激的HUVECs和HUVECs中，分別觀察第0天和第7天mRNA的表達水平。大多數分析的基因（總共26個基因）對TNF-α刺激沒有反應，GPC4 表達不受TNF-α刺激的影響，尤其是在HUVECs 中。分析表明，GPC4表達可能與膽固醇轉運相關基因的差異表達相關，無論是在第7天還是在第0天以及有與沒有TNF-α刺激的條件下。
接下來，將 HUVECs 暴露于流動刺激中 1 天或 10 天（10.2-10.8 dyne/cm²，即高剪切應力、層流模式；2.5-3.5 dyne/cm²，即低剪切應力、不均勻的流動模式），并使用免疫細胞化學染色觀察 GPC4 和 HS（圖1 A）。在初步實驗中，HUAECs和HUVECs之間GPC4和HS的表達沒有差異，因此，僅使用HUVECs進行動態(tài)流動實驗。結果觀察到免疫標記的GPC4和HS在層流區(qū)和湍流區(qū)在1天后的熒光強度呈正相關，在10天后減弱。
在1天和10天的流動刺激后，GPC4在非均勻流區(qū)的表達較層流區(qū)顯著降低（圖1 B，左）。GPC4的表達隨流動時間的延長總體呈下降趨勢。在層流和非均勻剪切應力區(qū)域，1天后HS的校正細胞總熒光有顯著差異，但在10天后無差異（圖1 B，右）。此外，觀察到HS表達模式的流動依賴性差異，在1天的流動之后，層流區(qū)域觀察到網狀模式，在非均勻剪切應力區(qū)域存在連續(xù)中斷，而10天后，兩個區(qū)域的模式都被破壞（圖1 C）。這說明GPC4的表達受剪切應力的調控。
圖1 流動條件下HUVECs中GPC4的表達。
在1天或10天的流動暴露后，用TNF-α刺激HUVECs，并量化THP-1細胞的粘附。在兩個暴露期，與非均勻剪切應力區(qū)相比，層流區(qū)域的THP-1粘附細胞數量顯著降低。非均勻區(qū)THP-1細胞粘附數量在10天后比1天后有增加的趨勢。
為了研究內皮GPC4是否在THP-1細胞粘附中起作用，通過siRNA轉染在HUVECs中敲低GPC4，并進行粘附測定。轉染GPC4 siRNA的HUVECs在層流和非均勻剪切應力區(qū)THP-1細胞粘附顯著高于轉染對照 siRNA的HUVECs，而VCAM-1和E-selectin的表達無顯著差異。用HS降解酶肝素酶III處理可降低HUVECs中的HS，但對THP-1單核細胞粘附無影響。此外，肝素酶III處理對GPC4 siRNA轉染的ECs對THP-1細胞粘附沒有額外的影響。
進一步地，實驗還分析了GPC4在體外表達中的可能的性別差異。雖然在靜態(tài)條件下培養(yǎng)的ECs的FACS分析中未觀察到性別差異，但發(fā)現，在層流和非均勻剪切應力區(qū)域的流動條件下，與男性樣本相比，女性的GPC4蛋白表達往往更高。此外，層流和非均勻剪切應力區(qū)域之間的差異在女性中比在男性中更明顯。然而，在HS的表達或THP-1細胞的粘附方面，男性和女性之間沒有發(fā)現顯著差異。
此外，還分析了糖萼成分在人類動脈粥樣硬化病變中的分布。GPC4、HS和 SDC4 的表達百分比在炎癥較重的PS中低于炎癥較輕的PS（圖2）。相關性分析表明，SDC4與HS的表達在重度和輕度炎癥的PS中均呈正相關，GPC4和HS之間以及GPC4和SDC4在炎癥較輕的PS中也觀察到這些正相關的趨勢。此外，HS與GPC4、HS與SDC4的表達也呈顯著正相關。
圖2 GPC4、HS和SDC4在所有斑塊切片（plaque sections，PS）中的表達。
最后，實驗將所有斑塊切片分為脆弱、穩(wěn)定或初始斑塊部分。初始斑塊切片顯示糖萼分子都沒有顯著差異。在穩(wěn)定斑塊切片中，SDC4和HS在炎癥程度較高和較低的PS區(qū)域的表達差異有統(tǒng)計學意義，而在GPC4中未達到統(tǒng)計學意義。在脆弱的斑塊切片中，與炎癥較輕的PS相比，炎癥較重的PS中GPC4明顯降低，而HS受影響較小。SDC4無顯著差異。
還比較了不同斑塊類型炎癥程度較高的PS中糖萼分子的表達模式。與脆弱斑塊和穩(wěn)定斑塊相比，GPC4和HS在初始斑塊中表達最高，而SDC4在這些斑塊類型中表達無差異（圖3 A、B）。有趣的是，僅在脆弱的斑塊切片中觀察到糖萼分子與炎癥程度較高的PS中CD68表達決定的局部炎癥呈強烈負相關，而在初始斑塊或穩(wěn)定斑塊切片中則沒有觀察到。這說明，糖萼成分的內皮表達取決于斑塊易損性和局部炎癥。
圖3 GPC4 （A）和HS（B）在不同斑塊類型切片中的表達比較。
該研究在體外和體內證明了不同糖萼分子在內皮細胞中表達的特點。動態(tài)粘附測定顯示，GPC4在動脈粥樣硬化發(fā)生的早期階段通過減弱免疫細胞對EC的早期粘附而具有潛在作用。GPC4和HS在人動脈粥樣硬化病變中的獨特表達突出了對炎癥和斑塊易損性的影響。雖然需要進一步的研究來闡明不同的機制，但上述數據表明內皮糖萼在心血管疾病中的臨床意義。
參考文獻：Urschel K, Hug KP, Zuo H, Büttner M, Furtmair R, Kuehn C, Stumpfe FM, Botos B, Achenbach S, Yuan Y, Dietel B, Tauchi M. The Shear Stress-Regulated Expression of Glypican-4 in Endothelial Dysfunction In Vitro and Its Clinical Significance in Atherosclerosis. Int J Mol Sci. 2023 Jul 18;24(14):11595. doi: 10.3390/ijms241411595. PMID: 37511353; PMCID: PMC10380765.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37511353/
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