小鼠模型在探究TAGLN2和CRNN異常表達在食管癌預防中的作用

食管癌是世界上最具侵襲性和致命性的惡性腫瘤之一，主要分為兩個亞型：食管鱗癌（Esophageal squamous cell carcinoma, ESCC）和食管腺癌（Esophageal adenocarcinoma, ESCA）。食管鱗狀上皮癌前病變（Esophageal squamous precancerous lesions, ESPL）是ESCC的前體病變，表現(xiàn)出從正常上皮（NE）到低級別（LGIN）和高級別（HGIN）上皮內(nèi)瘤變的進展，最終發(fā)展為浸潤性癌。一份長達13.5年的隨訪數(shù)據(jù)表明，較高級別的上皮內(nèi)瘤變與ESCC發(fā)生的風險明顯相關(guān)。目前，尚不明確哪些階段的ESPL最終會發(fā)展成ESCC，因此需要找到與ESPL進展為ESCC相關(guān)的風險指標，以進行精準預防。

2023年8月8日，鄭州大學董子鋼教授團隊和李翔教授團隊合作在《Nature Communications》雜志在線發(fā)表了題為“Spatial transcriptomics analysis of esophageal squamous precancerous lesions and their progression to esophageal cancer”的研究論文。該研究發(fā)現(xiàn)，TAGLN2和CRNN異常表達與食管狀上皮癌前病變向食管鱗癌進展相關(guān)，并有望成為食管癌早期干預標志物。
 

圖片來源：《Nature Communications》
（https://www.nature.com/articles/s41467-023-40343-5）

研究材料
在體內(nèi)研究中，研究人員構(gòu)建了食管鱗癌PDX模型（其中CB17-SCID雌性免疫缺陷小鼠由賽業(yè)生物提供），皮下接種瘤塊后，每周兩次瘤內(nèi)注射相應的慢病毒，觀察基因敲低或過表達對腫瘤生長的影響。

研究方法
作者采用了空間全轉(zhuǎn)錄組圖譜（WTA）、主成分分析（PCA）和差異表達基因分析（DEGs）等生物信息學技術(shù)，以及免疫組化染色（IHC）、WB、qPCR、MTT、克隆形成、類器官和PDX模型等體內(nèi)外實驗技術(shù)。

技術(shù)路線
01差異性表達基因的篩選：通過空間全轉(zhuǎn)錄組圖譜（WTA）、主成分分析（PCA）和差異表達基因分析（DEGs）篩選ESPL發(fā)展為ESCC過程顯著變化的基因。

02候選基因的確定和驗證：采用機器學習方法進一步確定潛在候選基因，并通過IHC染色驗證候選基因與ESCC進展的相關(guān)性。

03候選基因的調(diào)控機制研究：通過細胞增殖分析、集落形成測定和體內(nèi)研究探究候選基因?qū)�ESCC增殖的影響，及對正常食管細胞向惡性細胞轉(zhuǎn)變的作用。

研究結(jié)果
1.ESPL階段處于免疫抑制狀態(tài)，該狀態(tài)可能會減弱抗腫瘤免疫應答，從而促進ESCC的腫瘤發(fā)生
在該研究中，作者首先從生物過程、調(diào)控網(wǎng)絡、異常代謝途徑、異常信號傳導途徑和免疫相關(guān)途徑等方面對ESPL以及ESCC進行了分析（圖1 a, b）。研究發(fā)現(xiàn)成纖維細胞和M2巨噬細胞及調(diào)節(jié)T細胞（Treg）在LGIN和HGIN階段豐度增加，M1巨噬細胞減少（圖2 c-g），表明ESPL階段處于免疫抑制狀態(tài)，這可能會引起抗腫瘤免疫應答減弱，從而促進ESCC的腫瘤發(fā)生。主成分和差異表達基因（DEGs）分析以及各階段信號轉(zhuǎn)導通路變化顯示，類癌樣改變主要始于HGIN階段，提示患有高ESCC風險的LGIN患者應盡早治療。

圖1 ESPL狀態(tài)分析^[1]

2.候選基因的篩選
研究中發(fā)現(xiàn)一些DEGs在正常食管上皮細胞到ESCC的疾病進展過程中呈現(xiàn)逐步增加或減少的趨勢，這類基因很可能參與了ESCC的發(fā)展進程。該研究團隊采用機器學習方法篩選出潛在的與ESCC進展相關(guān)的候選基因，包括TAGLN2，CRNN，KRT16，KRT17和MAL（圖2 a-d）。免疫組化染色（IHC）檢測結(jié)果顯示TAGLN2和KRT16的蛋白水平在ESCC的進展過程中顯著增加，而CRNN的蛋白表達水平則降低（圖3 e），KRT17和MAL表達在各階段均無顯著性差異。另外，該團隊對同一病人由LGIN進展成HGIN及HGIN進展成ESCC前后配對的組織樣本進行分析，結(jié)果顯示與進展前的樣本相比，進展后的組織樣本中TAGLN2蛋白水平顯著增加，而CRNN的表達減少（圖3 a-d），KRT16在進展前后無顯著差異，進一步證實了TAGLN2和CRNN與ESCC進展的相關(guān)性。因此，作者選擇TAGLN2和CRNN開展下一步研究。
 

圖2 用于ESPL診斷和預測ESCC風險的潛在指標篩選^[1]
 

圖3 驗證候選基因與ESCC進展的相關(guān)性^[1]

3.候選基因在ESCC進展中的作用機制
該團隊通過細胞增殖、克隆形成、類器官和人源性組織異種移植（PDX）等體內(nèi)外實驗分析了候選基因在ESCC進展中的作用機制。在體內(nèi)研究中，研究人員構(gòu)建了食管鱗癌PDX模型（其中CB17-SCID雌性免疫缺陷小鼠由賽業(yè)生物提供），在小鼠皮下接種瘤塊后，每周兩次瘤內(nèi)注射相應的慢病毒，觀察基因敲低或過表達對腫瘤生長的影響。結(jié)果表明，敲低TAGLN2或過表達CRNN會抑制食管鱗癌細胞系、類器官和PDX腫瘤的生長（圖4）。在對正常食管上皮細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，TAGLN2促進了正常細胞向惡性細胞的轉(zhuǎn)化，而CRNN抑制了這種轉(zhuǎn)化。
 

圖4 候選基因在ESCC進展中的作用^[1]

研究結(jié)論
總的來說，TAGLN2通過調(diào)控細胞增殖促進ESCC的進展，而CRNN則通過對細胞增殖的調(diào)控抑制ESCC的進展。TAGLN2和CRNN有望作為ESPL向ESCC進展的潛在風險指標，有助于ESCC的預防和早期干預。該研究表明應該對食管癌前病變TAGLN2和CRNN異常表達的高危人群進行早期干預，為食管癌的精準預防提供了新思路。

原文檢索：
[1]Liu X, Zhao S, Wang K, Zhou L, Jiang M, Gao Y, Yang R, Yan S, Zhang W, Lu B, Liu F, Zhao R, Liu W, Zhang Z, Liu K, Li X, Dong Z. Spatial transcriptomics analysis of esophageal squamous precancerous lesions and their progression to esophageal cancer. Nat Commun. 2023 Aug 8;14(1):4779.