黑色素瘤中痛覺(jué)神經(jīng)元通過(guò)增加CGRP產(chǎn)生影響CD8+T細(xì)胞能力的研究

Nature文獻(xiàn)解析：疼痛竟然還可以幫助癌癥？快來(lái)一看究竟！

在癌細(xì)胞復(fù)雜的生物學(xué)特性中，有一個(gè)很少被討論但卻至關(guān)重要的組成部分：神經(jīng)纖維。 近期，一篇發(fā)表在Nature上的文獻(xiàn)《Nociceptor neurons affect cancer immunosurveillance》解釋了黑色素瘤如何利用神經(jīng)纖維生存【1】。黑色素瘤似乎利用了疼痛的力量來(lái)破壞我們身體的防御機(jī)制。

 

黑色素瘤與神經(jīng)相互作用

癌癥豐富的神經(jīng)纖維網(wǎng)絡(luò)是導(dǎo)致其發(fā)病的不常見(jiàn)因素之一【2】。例如，在前列腺癌中，神經(jīng)祖細(xì)胞最終會(huì)有助于腫瘤的發(fā)展和擴(kuò)散【3】。雖然神經(jīng)纖維嵌入腫瘤內(nèi)并不是什么新鮮事，但這種相互作用的后果，尤其是與疼痛信號(hào)感覺(jué)神經(jīng)元（痛覺(jué)神經(jīng)元）的相互作用的后果，卻一直難以捉摸。在這項(xiàng)令人難以置信的合作研究中，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)黑色素瘤細(xì)胞與這些痛覺(jué)神經(jīng)元相互作用時(shí)，它們不僅會(huì)促進(jìn)這些神經(jīng)元的生長(zhǎng)和活動(dòng)，而且還會(huì)提高它們對(duì)疼痛刺激的敏感性【4】。

 

提高疼痛探測(cè)器的靈敏度

黑色素瘤會(huì)主動(dòng)影響鄰近痛覺(jué)感受器的行為，使其反應(yīng)更加敏感。研究人員能夠證明，當(dāng)在黑色素瘤細(xì)胞存在的情況下培養(yǎng)痛覺(jué)感受器時(shí)，它們對(duì)疼痛刺激的反應(yīng)會(huì)增強(qiáng)，這說(shuō)明了黑色素瘤的操縱能力。
 

在探索黑色素瘤與神經(jīng)的相互作用時(shí)，他們注意到，盡管人類惡性細(xì)胞和免疫細(xì)胞都不表達(dá)神經(jīng)元起源基因（通過(guò) RNA 測(cè)序確定），但在黑色素瘤患者的活檢組織中卻能看到它們的表達(dá)。使用Alomone Lab的Anti-TRPV1 antibody(#ACC-030)來(lái)識(shí)別TRPV1+神經(jīng)元，他們發(fā)現(xiàn)這些神經(jīng)元與痛覺(jué)有關(guān)，與鄰近的健康組織相比，這些神經(jīng)元在黑色素瘤中的表達(dá)量大約增加了兩倍。有趣的是，他們發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TILs）的數(shù)量與這些疼痛受體的增加有關(guān)（圖 1）。

 

支配患者黑色素瘤的 TRPV1+ 神經(jīng)元

圖 1.患者黑色素瘤切片經(jīng)蘇木精-伊紅染色（a-f），并通過(guò)免疫組化方法分析 TRPV1（d-f；棕色）神經(jīng)元的存在（使用Alomone的Anti-TRPV1 antibody (#ACC-030))與鄰近的健康皮膚（藍(lán)色方框劃定；a,c,d,f）相比，腫瘤（紅色方框劃定；a-b,d-e）中的 TRPV1+ 神經(jīng)元（g）含量增加。腫瘤切片中 TRPV1 免疫標(biāo)記的增加主要與腫瘤浸潤(rùn)白細(xì)胞（h）水平的增加相關(guān)，這是對(duì)患者病理報(bào)告進(jìn)行回顧性相關(guān)分析后得出的結(jié)果。數(shù)據(jù)顯示為具有代表性的免疫組化圖像（a-f）、框須圖（從最小值到最大值；框從第 25 百分位數(shù)到第 75 百分位數(shù)，中間線表示中位數(shù)），其中單個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)已給出（g）或顯示皮爾遜相關(guān)性（R2）的熱圖（h）。人數(shù)如下：a-f：n=10；g：完整（n=8）、腫瘤（n=10）；h：n=10。切片由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)學(xué)病理學(xué)家盲法評(píng)分。P 值顯示在圖中，通過(guò)雙側(cè)非配對(duì)學(xué)生 t 檢驗(yàn)確定（g）。比例尺 = 100 μm（a,d），50 μm（b,c,e,f）。圖片和圖例來(lái)自 Balood, M. et al. (2022) Nature, 611(7935), 405-412.

 

為了深入探討這一問(wèn)題，我們將表達(dá) GFP 的黑色素瘤細(xì)胞引入特定品種的小鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤周圍和內(nèi)部存在大量 NaV1.8+ 痛覺(jué)感受器神經(jīng)元。其他體外研究表明，當(dāng) TRPV1+ 感受器和黑色素瘤細(xì)胞一起培養(yǎng)時(shí)，感受器會(huì)主動(dòng)向黑色素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。這種行為類似于癌癥的新血管生成，即形成新的血管為腫瘤提供營(yíng)養(yǎng)。
 

黑色素瘤似乎有能力改變痛覺(jué)感受器的敏感性。涉及有害配體的測(cè)試表明，黑色素瘤細(xì)胞會(huì)提高這些痛覺(jué)感受器的反應(yīng)能力，從而導(dǎo)致痛覺(jué)感受器的敏感性增強(qiáng)。當(dāng)DRG神經(jīng)元與黑色素瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基中會(huì)主動(dòng)釋放降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP），這是一種免疫調(diào)節(jié)神經(jīng)肽�；�因表達(dá)分析證實(shí)，與疼痛和疼痛調(diào)節(jié)有關(guān)的基因在接觸黑色素瘤細(xì)胞后發(fā)生了顯著變化。

 

SLPI 在痛覺(jué)感受器敏化中的作用

為了了解黑色素瘤致敏痛覺(jué)感受器的機(jī)制，我們開(kāi)發(fā)了一種模擬黑色素瘤環(huán)境的共培養(yǎng)系統(tǒng)。一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)是，當(dāng)黑色素瘤細(xì)胞與DRG神經(jīng)元或特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，分泌型白細(xì)胞蛋白酶抑制劑（SLPI）在黑色素瘤細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，SLPI 除了已知的功能外，還能激活 DRG 神經(jīng)元，尤其是痛覺(jué)神經(jīng)元。這種激活導(dǎo)致這些神經(jīng)元釋放 CGRP，從而揭示了黑色素瘤可能用于提高疼痛敏感性的途徑。體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，將SLPI引入小鼠體內(nèi)確實(shí)會(huì)導(dǎo)致疼痛敏感性增強(qiáng)。
 

研究人員還發(fā)現(xiàn)，黑色素瘤分泌的SLPI可作用于痛覺(jué)感受器，啟動(dòng)鈣離子流入、神經(jīng)肽釋放和熱超敏反應(yīng)。這表明，這些痛覺(jué)感受器可以檢測(cè)到惡性細(xì)胞的存在，并可能對(duì)其做出反應(yīng)。一個(gè)耐人尋味的觀察結(jié)果是，對(duì)熱痛敏感性的提高與腫瘤內(nèi)特異性免疫細(xì)胞的增加呈正相關(guān)（圖2）。

 

SLP1激活并作用于痛覺(jué)神經(jīng)元

圖2:腫瘤分泌的SLPI驅(qū)動(dòng)傷害感受器神經(jīng)元釋放CGRP。a-c、幼稚DRG神經(jīng)元(Trpv1cre::- cherff - egfpfl /WT)、B16F10-mCherryOVA細(xì)胞和ova特異性細(xì)胞毒性CD8+ T細(xì)胞單獨(dú)或聯(lián)合培養(yǎng)。48 h后，收集細(xì)胞，純化FACS并進(jìn)行RNA測(cè)序。a，分類神經(jīng)元分子圖譜的分層聚類描述了每組中富集的不同轉(zhuǎn)錄本組。b，計(jì)算deg，當(dāng)與ova特異性細(xì)胞毒性CD8+ T細(xì)胞、DRG神經(jīng)元或兩者共培養(yǎng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)Slpi在癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)。c, B16F10-mCherry-OVA細(xì)胞在與原始DRG神經(jīng)元和ova特異性細(xì)胞毒性CD8+ T細(xì)胞共培養(yǎng)(24 h或48 h)時(shí)分泌SLPI，在48 h后效果最大。d - f，使用鈣顯微鏡，我們發(fā)現(xiàn)SLPI (10 pg ml−1 - 10 ng ml−1)激活了大約20%培養(yǎng)的初始DRG神經(jīng)元(d,e)。用SLPI激活培養(yǎng)的神經(jīng)元(3小時(shí))也會(huì)導(dǎo)致CGRP的顯著釋放(f)。數(shù)據(jù)顯示為顯示標(biāo)準(zhǔn)化基因表達(dá)的熱圖(log2(1 + TPM) - mean (a))，框和哨子圖(如圖1b,c) (b)所定義)或mean±s.e.m。(氟)。N如下:a,b: N = 2-4組;c:除CD8+ T細(xì)胞外，其余各組n = 3 (n = 8);D: n = 17;E: n = 8 /組;f: 0 ng毫升−1 (n = 4), 0.1 ng毫升−1 (n = 5), 1 ng毫升−1 (n = 5), 5 ng毫升−1 (n = 4)。c-f的實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)了三次，結(jié)果相似。測(cè)序?qū)嶒?yàn)不重復(fù)(a,b)。P值采用事后Bonferroni (b,e,f)或雙側(cè)未配對(duì)Student 's t檢驗(yàn)(c)進(jìn)行單因素方差分析。*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001。

 

CGRP 的作用：一把雙刃劍

神經(jīng)肽 CGRP 是這一惡性聯(lián)盟的關(guān)鍵角色之一。CGRP 由這些超敏痛覺(jué)感受器大量產(chǎn)生，它有一個(gè)陰險(xiǎn)的作用：直接導(dǎo)致 CD8+ T 細(xì)胞衰竭，而 CD8+ T 細(xì)胞是我們的免疫系統(tǒng)抵御黑色素瘤的主要屏障。這又是為什么呢？T 細(xì)胞，尤其是具有細(xì)胞毒性的 CD8+ 細(xì)胞，完全有能力消除癌細(xì)胞等威脅。但 CGRP 似乎消耗了它們的活力，損害了它們抵御黑色素瘤入侵的能力。
 

利用三陰性黑色素瘤小鼠模型，將 B16F10-mCherry-OVA 細(xì)胞引入八周大的小鼠體內(nèi)。研究結(jié)果表明，在沒(méi)有痛覺(jué)感受器的情況下，小鼠的壽命不僅延長(zhǎng)了約 2.5 倍，而且腫瘤的生長(zhǎng)也明顯減少。值得注意的是，在腫瘤生長(zhǎng)減少的同時(shí)，細(xì)胞毒性腫瘤浸潤(rùn) CD8+ T 細(xì)胞也在增加。相反，在通過(guò)注射Alomone的Resiniferatoxin #(R-400)（TRPV1通道蛋白的激活劑）后，PD-1+LAG3+TIM3+ CD8+ T 細(xì)胞的比例明顯下降（圖 3）。
 

這些數(shù)據(jù)描繪了一幅令人信服的圖景，暗示痛覺(jué)神經(jīng)元在驅(qū)動(dòng)瘤內(nèi)衰竭 T 細(xì)胞群方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。有證據(jù)顯示，在瘤內(nèi) CD8+ T 細(xì)胞明顯衰竭前數(shù)天就出現(xiàn)了熱超敏反應(yīng)，這進(jìn)一步支持了這一假設(shè)。值得注意的是，這種痛覺(jué)過(guò)敏在任何可測(cè)量的腫瘤生長(zhǎng)之前就已出現(xiàn)。
 

細(xì)胞衰竭之所以重要，是因?yàn)樗ソ叩?T 細(xì)胞失去了功能效力，包括產(chǎn)生關(guān)鍵免疫分子（IFNγ、TNF 和 IL-2）的能力和增殖能力。這些 T 細(xì)胞還會(huì)同時(shí)增加衰竭標(biāo)記物（如 PD-1、LAG3 和 TIM3）的表達(dá)，從而降低它們消滅癌細(xì)胞的效率。

 

基因消融痛覺(jué)感受器可保護(hù)抗腫瘤免疫力

圖 3：a，野生型小鼠的左后爪注射異位 B16F10-mCherry-OVA 細(xì)胞（2 × 105 cells，i.d.）。腫瘤接種后第13天，瘤內(nèi)CD8+ T細(xì)胞衰竭與熱痛覺(jué)過(guò)敏呈正相關(guān)（R2 = 0.55，P ≤ 0.0001）。熱痛超敏度代表同側(cè)爪子（接種腫瘤）與對(duì)側(cè)爪子的退縮潛伏期比值。 b, 將異位 B16F10-mCherry-OVA （5 × 105 cells，i.d. ）接種到八周大的雄性和雌性小鼠的側(cè)腹，這些小鼠的感覺(jué)神經(jīng)元完好無(wú)損（Trpv1WT::DTAfl/WT）或被消融（Trpv1cre::DTAfl/WT）。c-f, 接種腫瘤 16 天后，感覺(jué)神經(jīng)元消減的小鼠腫瘤生長(zhǎng)減少（c），IFNγ+ CD8+ T 細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)增加（d），PD-1+LAG3+TIM3+ CD8+ T 細(xì)胞的比例減少（e）。B16F10-mCherry-OVA（5 × 105 cells，i.d.）腫瘤體積的減少在全身性耗竭 CD8+ T 細(xì)胞的神經(jīng)感受器缺失小鼠中不存在（f；評(píng)估至第 14 天；抗 CD8，每只小鼠 200 μg，i.p.，每 3 天一次）。g,h, 為了化學(xué)性地耗竭它們的神經(jīng)感受器神經(jīng)元，Rag1-/- 小鼠被注射了 RTX （Resiniferatoxin (R-400))。28 天后，給小鼠接種 B16F10-mCherry-OVA （5 × 105 個(gè)細(xì)胞，i.d.）。與藥物暴露的 Rag1-/ 小鼠相比，RTX 注射的小鼠經(jīng)收養(yǎng)轉(zhuǎn)入天真 OVA 特異性 CD8+ T 細(xì)胞（靜脈注射，1 × 106 個(gè)細(xì)胞，當(dāng)腫瘤達(dá)到約 500 mm3 時(shí)）后，腫瘤生長(zhǎng)（g；評(píng)估至第 19 天）和衰竭（h）均有所減少。數(shù)據(jù)顯示為線性回歸分析 ± s.e.（a）、Mantel-Cox 回歸（b）、平均值 ± s.e.m.（c,f,g）或箱輻圖（如圖 1b,c 所定義），并給出了單個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)（d,e,h）。n 如下：a：n = 60；b：完好（n = 62），消融（n = 73）；c：完好（n = 20），消融（n = 25）；d：完好（n = 24），消融（n = 23）；e：完整（n = 23），消融（n = 26）；f：完整 + 抗 CD8（n = 10），消融 + 抗 CD8（n = 8）；g：載體（n = 12），RTX（n = 10）；h：載體（n = 11），RTX（n = 10）。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)兩次（a,f-h）或六次（b-e），結(jié)果相似。P 值通過(guò)簡(jiǎn)單線性回歸分析（a）、Mantel-Cox 回歸分析（b）、雙向方差分析及事后 Bonferroni 檢驗(yàn)（c,f,g）或雙側(cè)非配對(duì)學(xué)生 t 檢驗(yàn)（d,e,h）確定。圖片和圖例來(lái)自 Balood, M. et al. (2022) Nature, 611(7935), 405-412.

 

為了解決早期消融神經(jīng)元亞群可能導(dǎo)致的代償性變化，研究人員使用肉毒桿菌神經(jīng)毒素A（BoNT/A）對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行了沉默處理。BoNT/A能有效減少腫瘤生長(zhǎng)，同時(shí)不影響腫瘤細(xì)胞和CD8+ T細(xì)胞的功能。然而，其療效似乎取決于痛覺(jué)神經(jīng)元的存在。我們采用了另一種方法，對(duì)已知的痛覺(jué)感受器選擇性策略的沉默效果進(jìn)行了研究。QX-314 被用來(lái)阻斷大孔離子通道，從而產(chǎn)生持久的電阻斷。值得注意的是，QX-314 不僅能減少黑色素瘤的生長(zhǎng)，還能保持瘤內(nèi) CD8+ T 細(xì)胞的完整性和功能性，從而加強(qiáng)了其在癌癥領(lǐng)域的潛在治療作用。

 

更廣闊的視野和對(duì)癌癥治療的影響

本文所述研究探討了黑色素瘤中痛覺(jué)神經(jīng)元的存在如何增加 CGRP 的產(chǎn)生，進(jìn)而影響腫瘤附近 CD8+ T 細(xì)胞的能力。CGRP 水平的升高與 CD8+ T 細(xì)胞中免疫檢查點(diǎn)受體的高表達(dá)相關(guān)，從而導(dǎo)致它們對(duì)抗腫瘤的能力減弱。
 

這種神經(jīng)和免疫系統(tǒng)的交會(huì)對(duì)黑色素瘤研究和癌癥治療具有深遠(yuǎn)的影響。深入了解 CGRP 在降低 CD8+ T 細(xì)胞抗癌能力方面的作用至關(guān)重要。我們現(xiàn)在知道，當(dāng)痛覺(jué)感受器神經(jīng)元的活動(dòng)受到抑制時(shí)，CD8+ T 細(xì)胞的功能仍能保持，這突出表明了 CGRP 在 T 細(xì)胞衰竭中的重要作用。此外，RAMP1拮抗劑BIBN4096在減少腫瘤生長(zhǎng)和CD8+ T細(xì)胞衰竭頻率方面表現(xiàn)良好，這表明該藥物有可能針對(duì)有利于腫瘤進(jìn)展的神經(jīng)-免疫相互作用。
 

這項(xiàng)研究的一些數(shù)據(jù)表明，黑色素瘤研究和癌癥治療有可能取得突破。作者推測(cè)，通過(guò)干擾CGRP-RAMP1軸，有可能使CD8+ T細(xì)胞重新煥發(fā)活力，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗黑色素瘤等癌癥的先天能力。這不僅為開(kāi)發(fā)針對(duì)CGRP-RAMP1軸的藥物打開(kāi)了大門(mén)，也為那些對(duì)目前的免疫療法（如免疫檢查點(diǎn)抑制劑）產(chǎn)生抗藥性的患者帶來(lái)了希望。通過(guò)解決助長(zhǎng)癌癥環(huán)境的神經(jīng)-免疫聯(lián)系，可以設(shè)想出新的治療策略，協(xié)同神經(jīng)和免疫系統(tǒng)的力量對(duì)抗惡性腫瘤。
 

黑色素瘤細(xì)胞與引發(fā)疼痛的神經(jīng)元之間的這種交織有助于我們理解疼痛的進(jìn)展。雖然疼痛與癌癥的交會(huì)乍看之下可能有悖常理或不太可能，但了解其動(dòng)態(tài)變化很可能會(huì)為黑色素瘤研究領(lǐng)域提供新的治療策略。

 

【1】Balood M, Ahmadi M, Eichwald T, et al. Nociceptor neurons affect cancer immunosurveillance[J]. Nature, 2022.

【2】Zahalka A H, Frenette P S. Nerves in cancer[J]. Nat Rev Cancer, 2020, 20(3): 143-157. 

【3】Magnon C, Hall SJ, Lin J, et al.Autonomic nerve development contributes to prostate cancer progression.Science. 2013 Jul 12;341(6142):1236361.

【4】Balood M, Ahmadi M, Eichwald T, et al. Nociceptor neurons affect cancer immunosurveillance. Nature. 2022;611(7935):405-412