準(zhǔn)確解讀細(xì)胞死亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果的技巧分享

摘要：細(xì)胞死亡是一個(gè)重要的生物過(guò)程，其檢測(cè)和測(cè)量過(guò)程困難，尤其是在多種檢測(cè)條件同時(shí)進(jìn)行時(shí)。由于測(cè)量技術(shù)的復(fù)雜性和該領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)化方法的缺乏，細(xì)胞死亡數(shù)據(jù)的解讀變得更加復(fù)雜。本文提供更多提示來(lái)幫助解釋細(xì)胞死亡實(shí)驗(yàn)。
 

關(guān)鍵詞：細(xì)胞死亡、數(shù)據(jù)解讀、細(xì)胞增殖、細(xì)胞死亡機(jī)制、細(xì)胞分析、細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞計(jì)數(shù)、活細(xì)胞成像
 

《Nature Cell Biology》期刊在2023年11月發(fā)表了一篇名為《Quick tips for interpreting cell death experiments》^[1]的文章，文中列舉了解讀細(xì)胞死亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果的多個(gè)技巧。

細(xì)胞死亡是動(dòng)物發(fā)育和維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，許多研究試圖了解細(xì)胞死亡是如何被調(diào)節(jié)的，也有研究試圖找到能夠觸發(fā)或防止細(xì)胞死亡的藥物。測(cè)量細(xì)胞死亡并清楚地呈現(xiàn)細(xì)胞死亡過(guò)程是一個(gè)艱巨的挑戰(zhàn)。這篇綜述提供了一些技巧來(lái)幫助解釋已發(fā)表的細(xì)胞死亡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。重點(diǎn)在于培養(yǎng)細(xì)胞中進(jìn)行的機(jī)制實(shí)驗(yàn)，在兩種或兩種以上的條件下比較細(xì)胞死亡的數(shù)量，這是許多研究中常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)方式。這些技巧是根據(jù)作者自己的研究、所遇到的問(wèn)題和失誤，以及盡可能仔細(xì)地測(cè)量細(xì)胞死亡而做出的努力得出的。
 

Tip1：如何檢測(cè)細(xì)胞死亡

活細(xì)胞、瀕死細(xì)胞和死細(xì)胞都會(huì)產(chǎn)生許多信號(hào)，通過(guò)這些信號(hào)可直接檢測(cè)或間接推斷細(xì)胞死亡（圖1a，b），重要的是要注意不同技術(shù)是如何檢測(cè)細(xì)胞死亡的。例如，使用流式細(xì)胞術(shù)或圖像法直接對(duì)群體中的單個(gè)活細(xì)胞和/或死細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。然而，許多研究中用來(lái)推斷細(xì)胞死亡的依據(jù)是群體中所有細(xì)胞獲得的大量代謝物，例如還原四唑基化合物（如使用MTT試劑盒）或測(cè)量總ATP豐度（如使用CellTiter-Glo）。雖然代謝數(shù)據(jù)相對(duì)簡(jiǎn)單且易于拓展到大量樣品，但這些方法不能直接測(cè)量細(xì)胞死亡且會(huì)受到技術(shù)干擾（例如在細(xì)胞凋亡早期，線(xiàn)粒體損傷會(huì)改變新陳代謝、增加ATP水平，與細(xì)胞死亡無(wú)關(guān)^[2]），在進(jìn)行這些操作時(shí)，減緩新陳代謝但不殺死細(xì)胞的情況也可能引起誤解。監(jiān)測(cè)細(xì)胞死亡途徑特異性生化變化（如凋亡過(guò)程中線(xiàn)粒體內(nèi)膜跨膜電位的喪失）可能有助于分析細(xì)胞死亡機(jī)制的誘發(fā)情況，但仍會(huì)受到其他限制，下文將進(jìn)行解析。

 

Tip2：如何分析細(xì)胞死亡

細(xì)胞死亡研究的常見(jiàn)比較方法是陰性對(duì)照與一種或多種處理?xiàng)l件之間進(jìn)行對(duì)比（圖1c）。如上文所述，需要注意的是監(jiān)測(cè)細(xì)胞死亡還是推斷細(xì)胞死亡。在使用大量代謝物進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，無(wú)法辨別治療處理是否會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡、減緩細(xì)胞增殖或?qū)е逻@些效應(yīng)的某種組合情況發(fā)生（圖1d），當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間處理細(xì)胞時(shí)這一問(wèn)題尤為突出，持續(xù)增殖、增殖停止或細(xì)胞死亡的綜合情況可能會(huì)發(fā)生。此外，只知道活細(xì)胞數(shù)或死細(xì)胞數(shù)難以了解藥物效果，例如，一個(gè)樣本起初有100個(gè)活細(xì)胞，后來(lái)有100個(gè)死細(xì)胞和0個(gè)活細(xì)胞，這與一個(gè)樣本起初有100個(gè)活細(xì)胞，后來(lái)有100個(gè)死細(xì)胞和400個(gè)活細(xì)胞是不同的。我們需要知道在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)的活細(xì)胞數(shù)以及在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的活細(xì)胞數(shù)和死細(xì)胞數(shù)，才能清楚地了解特定治療的效果^[3,4]。

 

Tip3：考慮時(shí)間對(duì)結(jié)果的影響

細(xì)胞死亡是隨時(shí)間推移而發(fā)生的過(guò)程，在最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡信號(hào)到達(dá)和實(shí)際質(zhì)膜破裂之間通常會(huì)發(fā)生一段信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)期，這個(gè)時(shí)間可以從幾分鐘、幾小時(shí)、或到幾天不等，這是致命刺激的性質(zhì)^[5]（圖1d）影響而造成的。因此，重要的是要注意何時(shí)進(jìn)行細(xì)胞死亡測(cè)量。通常會(huì)使用一個(gè)任意的終點(diǎn)（例如，6、24或48小時(shí)）。重要的是要考慮終點(diǎn)的選擇是否有生物學(xué)依據(jù)，以及如果提前或推遲測(cè)量結(jié)果會(huì)是怎樣。某些細(xì)胞死亡抑制劑或基因操作可能并不能完全阻止細(xì)胞死亡，而只是改變了細(xì)胞死亡的時(shí)間^[3]。因此，理想情況下細(xì)胞死亡是隨著時(shí)間的推移而測(cè)量的。在采用終點(diǎn)檢測(cè)法時(shí)，合理選擇時(shí)間點(diǎn)至關(guān)重要。

在質(zhì)膜破裂后的某個(gè)時(shí)刻，原始細(xì)胞物質(zhì)可能會(huì)完全解體（圖1a），這可能將導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞死亡的誤解。相對(duì)于細(xì)胞群中細(xì)胞死亡的開(kāi)始時(shí)間而言，過(guò)晚地測(cè)量可能意味著只有少量死亡細(xì)胞能保持足夠的完整性，無(wú)法通過(guò)任何方式對(duì)其進(jìn)行計(jì)數(shù)。如果一種擾動(dòng)迅速殺死了一些細(xì)胞，但剩余的活細(xì)胞繼續(xù)增殖直到較晚的實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，這可能會(huì)掩蓋早期的細(xì)胞死亡效應(yīng)，并導(dǎo)致一種“幸存者偏差”，即特定處理的致死效應(yīng)被忽視。對(duì)群體中的細(xì)胞死亡進(jìn)行延時(shí)測(cè)量有助于改善這些問(wèn)題^[3,4]。

 

Tip4：考慮細(xì)胞增殖對(duì)數(shù)據(jù)解釋的影響(第一部分)

特別是在使用終點(diǎn)法測(cè)定細(xì)胞活力時(shí)，細(xì)胞增殖可能會(huì)影響對(duì)細(xì)胞死亡的檢測(cè)和解釋。^[6]在對(duì)照條件下的活細(xì)胞數(shù)量通常會(huì)在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束之間會(huì)迅速增加。在已發(fā)表的研究中頻繁使用24或48小時(shí)作為時(shí)間終點(diǎn)的部分原因是需要在這些細(xì)胞本身密度過(guò)大導(dǎo)致細(xì)胞死亡之前從對(duì)照條件中捕獲數(shù)據(jù)(圖1d)。更重要的是，相對(duì)于任何處理過(guò)的細(xì)胞群體，對(duì)照細(xì)胞群體的無(wú)限增殖可能無(wú)意中導(dǎo)致被誤解為對(duì)細(xì)胞死亡的影響(圖1d)^[7]。

 

細(xì)胞增殖不會(huì)因許多致命的刺激而停止，在細(xì)胞死亡開(kāi)始前的幾個(gè)小時(shí)內(nèi)，活細(xì)胞的數(shù)量反而會(huì)繼續(xù)增加(圖1d)^[3]。另一方面，DNA損傷或生長(zhǎng)因子信號(hào)的抑制可引起雙相反應(yīng)，即細(xì)胞首先停止增殖，之后不再增殖的細(xì)胞發(fā)生死亡^[8]。這些動(dòng)態(tài)很難用任何類(lèi)型的終點(diǎn)分析來(lái)捕捉且不能輕易區(qū)分增殖停止和細(xì)胞死亡的大量代謝。隨著時(shí)間的推移，直接計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞的技術(shù)可以幫助捕捉這些效應(yīng)，并將細(xì)胞死亡歸一化到一個(gè)群體中觀察到的起始或max活細(xì)胞數(shù)^[3,4]。還開(kāi)發(fā)了一些特殊的指標(biāo)來(lái)衡量細(xì)胞增殖和細(xì)胞死亡是如何協(xié)調(diào)的，并有助于解釋群體水平上的細(xì)胞死亡^[7]。

 

Tip5：考慮細(xì)胞增殖對(duì)數(shù)據(jù)解釋的影響(第二部分)

同時(shí)檢查一種處理對(duì)許多不同細(xì)胞系的影響是非常常見(jiàn)的。細(xì)胞系之間細(xì)胞增殖速率的差異會(huì)很大程度地影響對(duì)這些數(shù)據(jù)的解釋。尤其在批量測(cè)定細(xì)胞活力時(shí)，相比于增殖較快的細(xì)胞，生長(zhǎng)較慢的細(xì)胞通常對(duì)治療誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡表現(xiàn)出更強(qiáng)的抵抗力。HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞往往比培養(yǎng)的其他乳腺癌細(xì)胞增殖得更慢，因此傳統(tǒng)的測(cè)量方法無(wú)法捕捉到這些細(xì)胞對(duì)HER2抑制劑的獨(dú)特敏感性。歸一化方法可以減輕生長(zhǎng)速率變化的混雜效應(yīng)，更準(zhǔn)確地測(cè)量處理因素誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡^[8,9]。

 

Tip6：數(shù)據(jù)規(guī)范化

細(xì)胞活力或細(xì)胞死亡通常以標(biāo)準(zhǔn)化和簡(jiǎn)化的模式呈現(xiàn)（例如0到1或0%到100%的細(xì)胞死亡）。當(dāng)使用大量代謝物計(jì)算時(shí)，通常減去培養(yǎng)基或培養(yǎng)容器產(chǎn)生的背景信號(hào)來(lái)對(duì)結(jié)果進(jìn)行歸一化處理，然后將實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組進(jìn)行比對(duì)。“細(xì)胞活力”降低50%可能表示所有細(xì)胞的增殖速度減慢50%，也可能表示群體中某些細(xì)胞死亡而其他細(xì)胞存活并增殖。

 

在一些研究中，結(jié)果被進(jìn)一步抽象為相對(duì)于對(duì)照組的“細(xì)胞死亡百分比變化”。如果沒(méi)有進(jìn)一步的信息，就無(wú)法獲知細(xì)胞群中多少細(xì)胞死亡。“細(xì)胞死亡增加100%”可以解釋為2%和4%的死亡細(xì)胞之間的差異，也可能意味著40%和80%的死亡細(xì)胞之間的差異。這種形式的數(shù)據(jù)歸一化可能會(huì)影響我們對(duì)生物效應(yīng)的判斷。其他的簡(jiǎn)化方法，如以熱圖形式顯示匯總數(shù)據(jù)，可以簡(jiǎn)明扼要地傳達(dá)許多觀測(cè)值。這些描述只顯示了平均值，不同條件下存在的生物變異性仍不清楚。有時(shí)，應(yīng)用的歸一化和簡(jiǎn)化程度越多，就越難直觀地理解一種處理方法如何影響細(xì)胞死亡。

 

Tip7：仔細(xì)檢查圖表標(biāo)注

細(xì)胞死亡數(shù)據(jù)結(jié)果的呈現(xiàn)方式會(huì)影響我們對(duì)這些結(jié)果的解讀。細(xì)胞死亡分析通常以x-y圖的形式呈現(xiàn)，其中y軸是“細(xì)胞死亡”的某種測(cè)量值。衡量標(biāo)準(zhǔn)可能包括活細(xì)胞計(jì)數(shù)、死細(xì)胞計(jì)數(shù)、群體中檢測(cè)到的細(xì)胞死亡標(biāo)記物的數(shù)量或群體代謝活動(dòng)。需要特別注意這些不同類(lèi)型的數(shù)據(jù)在y軸是如何標(biāo)注的，尤其是來(lái)自不同檢測(cè)方法的數(shù)據(jù)被歸一化并轉(zhuǎn)換成“細(xì)胞死亡百分比”或“細(xì)胞存活百分比”值時(shí)。如上所述，大量代謝物讀數(shù)并不直接體現(xiàn)細(xì)胞死亡情況，但有時(shí)會(huì)被作為細(xì)胞死亡的衡量標(biāo)準(zhǔn)。同樣，僅對(duì)細(xì)胞死亡或死細(xì)胞情況進(jìn)行定量也不一定能有效說(shuō)明群體中細(xì)胞死亡的總體水平。理想情況下，y軸應(yīng)標(biāo)注實(shí)際的測(cè)量值，以避免數(shù)據(jù)被過(guò)度解讀或誤讀的風(fēng)險(xiǎn)。此外，y軸的范圍也很重要，有時(shí)y軸不是呈現(xiàn)一個(gè)完整的范圍（0-100%），而是被限制在一組有限的值之間，這往往會(huì)在視覺(jué)上放大差異。

 

Tip8：注意細(xì)胞菌株和細(xì)胞培養(yǎng)條件

細(xì)胞供應(yīng)源、傳代數(shù)和生長(zhǎng)條件是細(xì)胞死亡實(shí)驗(yàn)中的重要變量。培養(yǎng)中的細(xì)胞在不斷變化，這種變化可能導(dǎo)致不同實(shí)驗(yàn)室使用的同一細(xì)胞系菌株之間細(xì)胞死亡的差異[9]。細(xì)胞死亡反應(yīng)也會(huì)因生長(zhǎng)培養(yǎng)基成分、細(xì)胞數(shù)量或培養(yǎng)容器中的細(xì)胞匯合度不同而存在差異。因此，關(guān)注上述變量至關(guān)重要。在某些情況下，實(shí)驗(yàn)之間、實(shí)驗(yàn)室之間的結(jié)果差異可以用細(xì)胞系克隆漂移、檢測(cè)細(xì)胞融合差異及細(xì)胞生長(zhǎng)條件來(lái)解釋^[11,12]。雖然細(xì)胞死亡數(shù)據(jù)的報(bào)告程序在不斷改進(jìn)，但是存在的變量以及差異并不是一直出現(xiàn)在所公布的方法內(nèi)。

 

Tip 9：關(guān)注效應(yīng)量和可重復(fù)性

可重復(fù)性是生物學(xué)研究中的重大難題。即使是相對(duì)簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，也包含數(shù)十個(gè)潛在的誤差來(lái)源，這些誤差來(lái)源與原材料、試劑、細(xì)胞培養(yǎng)和接種條件、移液器校準(zhǔn)等有關(guān)^[13]。即使盡可能使用相同的試劑和實(shí)驗(yàn)方案，不同實(shí)驗(yàn)室的細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍然會(huì)有差異^[11]。 重要的是要考慮到，在細(xì)胞死亡研究中，實(shí)驗(yàn)誤差或隨機(jī)誤差可能是造成不同條件下觀察到差異的原因。

 

結(jié)果可重復(fù)性是避免誤差的一道重要防線(xiàn)。在細(xì)胞生物學(xué)和動(dòng)物研究中，實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性究竟是什么呢？已發(fā)表的研究報(bào)告在這一點(diǎn)上并不明確。有些研究認(rèn)為在多孔板的平行孔中同時(shí)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)是“獨(dú)立”的重復(fù)，這種方法節(jié)省了時(shí)間，但很大限度地降低了生物變異性和系統(tǒng)性產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)。有時(shí)實(shí)驗(yàn)會(huì)在不同時(shí)間出結(jié)果，但只有一個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)會(huì)作為代表性數(shù)據(jù)顯示出來(lái)，這就很難評(píng)估其生物變異程度。

 

細(xì)胞和試劑即使來(lái)自同一動(dòng)物或同一批次，在不同時(shí)間進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)也會(huì)存在類(lèi)似的潛在混淆風(fēng)險(xiǎn)。因此需謹(jǐn)慎對(duì)待規(guī)模較小、在獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中未重復(fù)且僅在一種環(huán)境中得到驗(yàn)證的細(xì)胞死亡。在一種細(xì)胞系中獲得的細(xì)胞死亡發(fā)現(xiàn)是否也能在另一種細(xì)胞系中獲得，以及獨(dú)立和正交的方法（如細(xì)胞死亡機(jī)制特異性標(biāo)記物的生化讀數(shù)和活細(xì)胞與死細(xì)胞成像計(jì)數(shù)）是否都指向相同的機(jī)制結(jié)論[14]也是關(guān)鍵問(wèn)題之一。由兩個(gè)或更多個(gè)獨(dú)立研究小組得出的類(lèi)似機(jī)制發(fā)現(xiàn)其可信度會(huì)更高，并且比僅在單個(gè)實(shí)驗(yàn)室中獲得的任何結(jié)果更具有普遍性。

 

Tip 10：仔細(xì)評(píng)估細(xì)胞死亡機(jī)制

細(xì)胞死亡可以通過(guò)細(xì)胞凋亡或幾種非凋亡細(xì)胞死亡機(jī)制之一進(jìn)行，這些機(jī)制并不容易區(qū)分。研究者有必要關(guān)注如何監(jiān)測(cè)不同的細(xì)胞死亡機(jī)制。細(xì)胞死亡機(jī)制特異性標(biāo)志物會(huì)報(bào)告一種細(xì)胞死亡機(jī)制的激活情況，但對(duì)可能同時(shí)發(fā)生的其他細(xì)胞死亡機(jī)制視而不見(jiàn)。我們漸漸深入發(fā)現(xiàn)了一些機(jī)制特異性細(xì)胞死亡標(biāo)志物。例如，磷脂酰絲氨酸結(jié)合Annexin V歷來(lái)被用作細(xì)胞凋亡的標(biāo)志物，但磷脂酰絲氨酸也可能暴露在經(jīng)歷壞死性凋亡和其他形式的非凋亡細(xì)胞死亡的細(xì)胞表面^[15]。在解釋使用機(jī)制特異性細(xì)胞死亡抑制劑獲得的結(jié)果時(shí)也需要謹(jǐn)慎，這可能會(huì)產(chǎn)生脫靶效應(yīng)。例如一些小分子具有獨(dú)立于蛋白質(zhì)結(jié)合的隱自由基捕獲抗氧化活性，可抑制鐵死亡^[16]。通過(guò)不斷完善和更新用于評(píng)估細(xì)胞死亡機(jī)制的標(biāo)準(zhǔn)，有可能更清晰地解釋現(xiàn)有數(shù)據(jù)和新數(shù)據(jù)。

 

與細(xì)胞死亡檢測(cè)相關(guān)的問(wèn)題概述

a、活細(xì)胞、瀕死細(xì)胞和死細(xì)胞可以產(chǎn)生獨(dú)特的和可測(cè)量的信號(hào)。b、常見(jiàn)細(xì)胞活力和細(xì)胞死亡定量方法舉例。FLICK，基于熒光和裂解的細(xì)胞死亡動(dòng)力學(xué)推斷；LDH，乳酸脫氫酶；MTT，3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide；PI，碘化丙啶；SPARKL，使用實(shí)時(shí)動(dòng)力學(xué)標(biāo)記的單細(xì)胞和群體水平分析；STACK，可擴(kuò)展的細(xì)胞死亡動(dòng)力學(xué)延時(shí)分析。 c、多孔板中典型的細(xì)胞死亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示例。d、七種不同的變量和因素會(huì)影響細(xì)胞死亡實(shí)驗(yàn)的解釋。在使用終點(diǎn)測(cè)量法和間接生化檢測(cè)法（如 ATP 總豐度或四氮唑還原強(qiáng)度）時(shí)，這些影響混淆數(shù)據(jù)解釋的可能性尤為嚴(yán)重。

 

那么有什么樣的工具可以有助于細(xì)胞死亡檢測(cè)呢？

 

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