腫瘤微環(huán)境模擬技術AVATAR在CAR-T療法征服實體瘤治療的應用

嵌合抗原受體（CAR-T）細胞療法在治療包括實體瘤在內(nèi)的各種癌癥方面具有很大的前景。但是科學家也發(fā)現(xiàn)，對CAR-T治療血癌和實體瘤的行為以及有效性進行建模一直具有挑戰(zhàn)性，這是因為癌細胞具有獨特的腫瘤微環(huán)境。腫瘤微環(huán)境（TME）的特征通常為缺氧、酸度增加和高間質(zhì)液壓，這使癌癥細胞能夠有效逃避免疫監(jiān)測。這種免疫抑制性TME也會導致CAR-T細胞耗竭，從而限制其抗腫瘤活性和功能。

圖1.AVATAR模擬細胞腫瘤微環(huán)境

 

為了解決這些問題，我們開發(fā)了一種新的基于細胞的檢測方法，在三維（3D）體外細胞培養(yǎng)系統(tǒng)、人類急性B細胞淋巴細胞白血病小鼠模型和免疫抑制腫瘤微環(huán)境中測量CAR-T細胞的效力和細胞毒性功能。利用這個獨特設計的體外培養(yǎng)系統(tǒng)（AVATAR），我們再現(xiàn)了在脈管系統(tǒng)、骨髓和實體瘤微環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的氧氣和間質(zhì)流體壓力，然后通過流式細胞術和電阻抗等技術分析細胞耗竭進而測定在這些環(huán)境下的腫瘤細胞溶解，并通過進行一系列腫瘤激發(fā)試驗來檢測了CAR-T抗腫瘤的活力和有效性。

圖2.使用AVATAR提供加壓TME培養(yǎng)條件

 

結(jié)果展示

1.加壓TME條件增強病毒轉(zhuǎn)導，增加CD19 CAR-T+細胞總數(shù)

用CD19-CAR慢病毒轉(zhuǎn)染活化的T細胞，并在標準培養(yǎng)箱或AVTAR培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，然后通過流式細胞術進行分析。在AVTAR系統(tǒng)中生長的細胞顯示出5-7%的轉(zhuǎn)導效率增加以及20%的生長能力增加。

圖3.CD19-CAR-T細胞的特性

 

2.TME條件提高了CAR-T擴增率，增加了CD19 CAR-T+細胞的總數(shù)

將相同數(shù)量的CD19-CAR-T細胞（5.0E+05）在不同的O2%和壓力條件下培養(yǎng)11天，并用AO/PI方法每天計數(shù)細胞數(shù)量。在培養(yǎng)期結(jié)束時，在低壓/缺氧條件下（CAR-T 15%O2+0 PSI）的AVATAR培養(yǎng)箱中的細胞具有最高的生長速率。

圖4.CD19-CAR-T細胞生長曲線

 

3.靶向腫瘤殺傷試驗中加壓TME條件提高CD19-CAR-T的存活率

CAR-T細胞與靶細胞（NALM6或MV-4-11，5.0E+04/孔）以不同的E:T比共培養(yǎng)20h，然后通過流式細胞術分析細胞毒性，收集細胞上清液進行IFN-γ定量。與正常培養(yǎng)箱相比，在AVATAR培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的CAR-T細胞具有更高的靶細胞殺傷能力，但在這些組中未檢測到IFN-γ分泌的變化。

圖5.CD19-CAR-T殺傷試驗的細胞毒性和細胞因子結(jié)果

 

4.靶向腫瘤殺傷試驗中加壓TME條件維持CD19 CAR-T的效力

CD19 CAR-T細胞在Normoxic（21%O2+0PSI）或TME（AVTAR:1%O2+2PSI）培養(yǎng)條件下擴增。CD19 CAR-T細胞對NALM6的殺傷是在Normoxic或TME條件下進行的。與ST162供體來源的CD19 CAR-T細胞相比，ST164供體來源的CD19 CAR-T細胞顯示出10%的細胞毒性增加。供體來源的CAR -Ts在CD4/8人群中表現(xiàn)出顯著的變化，向CD4人群傾斜。有趣的是，更高的E:T比率并沒有導致更多的目標殺傷。

圖6.在共培養(yǎng)中CD19 CAR-T特異性殺傷NALM6細胞

 

5.在一系列腫瘤激發(fā)試驗中加壓TME條件增強ROR1 CAR-T效力

圖7.一系列腫瘤激發(fā)試驗中不同TME條件下ROR1 CAR-T的效力

 

6.免疫抑制TME篩選條件下加壓TME條件增強ROR1 CAR-T效力

腫瘤細胞溶解測定：將靶細胞SKOV3（ATCC）以每孔5K個細胞（96孔形式）接種。在效應細胞（ROR1 CAR-T細胞）以10∶1的效靶比（50K）引入之前，使靶細胞粘附24小時。在Normoxia（21%O2&0pSI）或TME（1%O2&2PSI）下進行細胞殺傷測定。在CO2培養(yǎng)箱或AVTAR系統(tǒng)（環(huán)境O2+4PSI）中轉(zhuǎn)導ROR1 CAR-T細胞并擴增9天。在共培養(yǎng)48小時后進行IFN-γ分泌測定（BD cat#555142）。使用BD Fortessa X-20對Naïve cells（CCR7+CD45RA+）、中央記憶（CCR7+CD45RA-）、效應記憶（CCF7-CD45RA-）進行流式細胞術檢測。

圖8.腫瘤細胞溶解測定

 

我們使用靶向卵巢腺癌細胞系SKOV3的抗受體酪氨酸激酶樣孤兒受體1（ROR1）CAR-T細胞進行了概念驗證實驗。CD19 CAR-T被用來靶向急性淋巴細胞白血病細胞系NALM6。我們評估了效應T細胞與腫瘤細胞的特定比例，以模擬體外CAR-T的效力，并且通過效應T細胞對腫瘤細胞的比率的增加證實了CD19 CAR-T介導的細胞毒性的升高。這些篩選實驗的初步結(jié)果顯示，在TME條件下，ROR1 CAR-T介導的細胞毒性顯著下降，CD19 CAR-T表現(xiàn)出有效的細胞殺傷力。我們還發(fā)現(xiàn)了有趣的一點，在高壓和低氧培養(yǎng)（AVTAR）條件下，ROR1 CAR-T細胞效力水平明顯提高，這值得進一步研究。

 

關于AVATAR

個體化細胞控制系統(tǒng)AVATAR可以自由控制培養(yǎng)環(huán)境中的氧氣含量和壓力強度，在體外精準模擬出加壓和缺氧的腫瘤微環(huán)境條件，使研究人員能夠在接近真實的環(huán)境中研究藥物作用機制、評估治療效果，得到更加科學的結(jié)果，同時也減少項目的優(yōu)化時間與成本費用。