用SMART-Seq®單細胞技術(shù)推動單細胞RNA-seq的極限

將MANTIS®液體處理器集成到一個新的工作流程中，用于分析單細胞的全長轉(zhuǎn)錄組，使實驗小型化

 

單細胞RNA測序(scRNA-seq)是一種用于研究單個細胞轉(zhuǎn)錄譜的技術(shù)。與傳統(tǒng)的大群體測序不同，它強調(diào)了mRNA水平的細胞-細胞變異，更深入地了解健康和疾病的先決條件。scRNAseq的主要挑戰(zhàn)來自于單個細胞只包含少量的mRNA。從極其有限的材料中提取有意義的生物信息需要具有特殊靈敏度和重現(xiàn)性的scRNA-seq制備方法。

 

為了解決這一需求，Takara Bio的研究人員開發(fā)了SMART-Seq®單細胞試劑盒(SSsc)。SSsc通過直接從單個細胞中生成高質(zhì)量的全長cDNA，僅用2pg的RNA就能提供敏感且高重復性的結(jié)果。最近，通過將FORMULATRIX®旗下MANTIS®液體處理器集成到SSsc工作流程中，可以在不影響產(chǎn)量、靈敏度、重復性的情況下將反應體積縮小到原來的四分之一，進一步增強了這種強大的新一代測序技術(shù)的實用性。

 

SMART-Seq®單細胞試劑盒技術(shù)的幾個優(yōu)點

 

與現(xiàn)有的用于制備scRNA-seq樣品的技術(shù)相比，SSsc有幾個優(yōu)點。這包括優(yōu)越的靈敏度和重復性；一個簡單的、模板化的工作流；以及不受小型化影響的強勁性能。

 

考慮到SSsc的靈敏性和重復性，Takara的研究人員已經(jīng)證明SSsc比廣泛使用的Smart-seq2技術(shù)檢測到更多的淋巴母細胞系 (GM12878)基因，同時斯皮爾曼相關性系數(shù)顯示SSsc具有更高的重復性( 圖 1 ) 。在此對比分析 中，SSsc方法具有良好的精度，沒有缺失值，在384個Cq值的標準偏差為 0.133，在0.5個周期內(nèi)，99.5%的數(shù)據(jù)點都落在半圓內(nèi)。這種性能尤其對RNA含量極低的細胞進行測序擁有極高的價值，它可以用來識別罕見的基因或檢測單核苷酸多態(tài)性(SNPs)。

圖1:SMART-Seq®單細胞試劑盒優(yōu)于Smart-seq2。采用SSsc(18個細胞)或Smartseq2 (20個細胞; Picelli et al. 20141) 對淋巴母細胞系(GM12878)基因的gle細胞進行19個周期的PCR處理。如上所述，生成RNA-seq庫，將所有樣本標準化至175萬雙端reads后，分析se-quences。圖a是在處理SSsc的細胞中檢測到的更多基因。圖B相關箱形圖顯示SSsc處理的細胞之間具有更高的斯皮爾曼相關性，這表明與Smartseq2相比具有更高的重復性。

 

一個簡單的、模板化的工作流

 

SMART-Seq®單細胞試劑盒采用了一個簡單的、模板化的工作流程，包括將細胞分配到預先準備的孔板上，反向轉(zhuǎn)錄RNA，然后通過PCR擴增得到的cDNA；然后在定量或者庫準備之前對其進行純化。圖2總結(jié)了原始的、完整工作流程，橙色標記出了轉(zhuǎn)移到MANTIS液體處理器上完成的步驟。

圖2：SSsc工作流。使用MANTIS®液體處理器進行的步驟以橙色顯示。

 

使用MANTIS®液體處理器，實現(xiàn)了穩(wěn)健實驗的小型化

 

通過將MANTIS®液體處理器引入SSsc工作流程，Takara的研究人員已經(jīng)能夠自動化三個關鍵的步驟：孔板制備、添加RT master mix、添加PCR master mix，如圖2所示。這不僅提高了工作流效率，而且還使SSsc工藝能夠轉(zhuǎn)移到384孔板上，從而使反應體積減少到四分之一，獲得更高、更有價值的靈敏度。

圖3:MANTIS®顯示移液管尖端通過小管連接到高容量(HV)芯片上。

 

使用MANTIS液體處理器運行的全體積 和四分之一體積SSsc工作流的性能類如 圖4所示。在這兩種情況下，每個細胞大約產(chǎn)生60-80 ng的cDNA，鑒定出的基因數(shù)量相似。從圖5中可以看出，降低整體體積并沒有降低靈敏度或重復性，強調(diào)了SSsc與小型化的兼容性。

 

四份已經(jīng)詳細制定的實驗方案，規(guī)定了在MANTIS液體處理器上執(zhí)行SSsc配件的分步工作流程，描述了96孔板中的全體積、半體積和四分之一體積反應大小，以及384孔板中的四分之一體積反應大小。這些實驗方案可從FORMULATRIX網(wǎng)站下載。

  

圖4:使用MANTIS®液體處理器進行全體積和四分之一體積移液的工作流程的相似產(chǎn)量和靈敏度。

 

圖5:組內(nèi)Pearson(圖A)或Spearman(圖B)在全體積或四分之一體積下處理的所有細胞之間的相關性表明，重復性和靈敏度不會因體積減少而受到影響。

 

SMART-Seq®單細胞試劑盒為進行全長轉(zhuǎn)錄組分析提供了許多好處，這種有價值的新一代測序技術(shù)的范圍可以通過集成MANTIS液體處理器到SSsc工作流程，進一步擴展。通過將SSsc的靈敏度和重復性與MANTIS液體處理器提供的樣品處理效率、更小的反應體積相結(jié)合，研究人員可以實現(xiàn)對珍貴樣品材料越來越詳細的表征。

 

可以從FORMULATRIX網(wǎng)站的參考資料頁面下載使用Smart-Seq®單細胞試劑盒在MANTIS液體處理器上的全體積、半體積、四分之一體積和384-孔板四分之一體積的詳細實驗步驟。