長(zhǎng)鏈非編碼RNA SNHG8通過在缺氧炎癥環(huán)境中釋放HIF-1α來激活NF-κB

正畸牙齒移動(dòng)（OTM）是由機(jī)械力刺激引起的一種獨(dú)特的骨重塑過程。在牙槽骨重塑之前，局部微環(huán)境中會(huì)出現(xiàn)一系列復(fù)雜且協(xié)調(diào)的生化信號(hào)，包括炎癥反應(yīng)和缺氧反應(yīng)。牙周膜細(xì)胞（PDLCs）是牙周組織中的主要功能細(xì)胞，在牙周組織重塑過程中對(duì)機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)至關(guān)重要，由于血液供應(yīng)減少，可能會(huì)出現(xiàn)暫時(shí)性缺氧。參與缺氧反應(yīng)的缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）在牙周膜的壓力側(cè)和張力側(cè)均升高。然而，很少有研究調(diào)查 HIF-1α 在 OTM 期間在 PDLCs 中的作用。

牙周組織重塑伴有無菌性炎癥。NF-κB 通路被正畸刺激激活，從而觸發(fā)下游生化事件。抑制 NF-κB 可顯著阻斷 OTM 并減少破骨細(xì)胞的形成。免疫細(xì)胞中的 HIF-1α 和 NF-κB 通路之間發(fā)生廣泛的串?dāng)_，特別是在病理情況下。然而，在 OTMs 的生理?xiàng)l件下，PDLCs 中 NF-κB 通路的活性是否受 HIF-1α 的影響尚不清楚。

lncRNA SNHG8 通過在腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中海綿化 miR-425-5p 來抑制 sirtuin1 介導(dǎo)的 NF-κB 通路。此外，在缺氧條件下，SNHG8 表達(dá)在 H9c2 大鼠心肌細(xì)胞中上調(diào)，并激活 NF-κB 通路。因此，在某些表型情況下，SNHG8 與炎癥和缺氧反應(yīng)密切相關(guān)，也可能在正畸力誘導(dǎo)的協(xié)調(diào)生化反應(yīng)中發(fā)揮作用。然而，SNHG8 的表達(dá)模式及其在 OTM 過程中對(duì) NF-κB 通路的影響尚不清楚。

基于此，北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院正畸科及中日友好醫(yī)院口腔科的研究團(tuán)隊(duì)曾探索了 SNHG8 是否對(duì)正畸刺激有反應(yīng)，以及其對(duì) OTM 期間 PDLCs 中 NF-κB 通路的影響以及潛在的機(jī)制。具體內(nèi)容發(fā)表在 Stem Cell Research & Therapy 期刊題為“A reduced level of the long non-coding RNA SNHG8 activates the NF-kappaB pathway by releasing functional HIF-1alpha in a hypoxic inflammatory microenvironment”。
 

首先，實(shí)驗(yàn)通過施加正畸力3天建立 OTM 模型。免疫組化染色顯示，HIF-1α 在磨牙近中壓力側(cè) PDL 組織中的表達(dá)明顯升高。受力7天后，qRT-PCR 結(jié)果顯示，HIF-1α mRNA 水平略有升高，而 IL-1β 和 TNF-α 水平顯著升高。相比之下，SNHG8 mRNA 水平顯著下降。

然后將 PDLCs 暴露于靜態(tài)壓縮力（2 g/cm²）（圖1 A）。qRT-PCR 結(jié)果顯示，HIF-1α 和炎癥因子 IL-1β、IL-6、IL-8 和 TNF-α 的 mRNA 水平以時(shí)間依賴性方式顯著升高，而SNHG8 以時(shí)間依賴性方式下調(diào)（圖1 B）。此外，Western blot 顯示 HIF-1α 蛋白水平呈先上調(diào)后下調(diào)的變化。phos-p65 的上調(diào)和 IκBα 的下調(diào)表明 NF-κB 通路的激活（圖1 C）。這表明，機(jī)械力上調(diào) PDLCs 中的缺氧和炎癥反應(yīng)并下調(diào) SNHG8。

圖1 機(jī)械力上調(diào) PDLCs 中的缺氧和炎癥反應(yīng)并下調(diào) SNHG8。

細(xì)胞受到靜態(tài)壓縮力 0、6、12、24 h。（A）施加的壓縮力。（B）qRT-PCR結(jié)果顯示，施加力后PDLCs中SNHG8、HIF-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表達(dá)。（C）施加力后 HIF-1α、p65、phos-p65 和 IκBα 的蛋白質(zhì)印跡分析。

體內(nèi)和體外結(jié)果顯示，正畸力負(fù)荷上調(diào)炎癥因子，顯著下調(diào) SNHG8。接下來，為了確定 SNHG8 是否參與 PDLCs 中 NF-κB 通路的調(diào)控，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行轉(zhuǎn)染以敲低或過表達(dá) SNHG8。熒光顯微鏡顯示，慢病毒轉(zhuǎn)染后，約 80% 的 PDLCs 表達(dá)綠色熒光蛋白（圖2 A）。qRT-PCR 結(jié)果顯示，SNHG8 在敲低組中下調(diào)約60%，在過表達(dá)組中下調(diào) 100% 以上（圖2 B）。PDLCs 中的 NF-κB 信號(hào)通路被 TNF-α 激活，qRT-PCR 顯示 IL-1β、IL-6 和 IL-8 以濃度和時(shí)間依賴性方式顯著上調(diào)（圖2 C）。因此，在隨后的實(shí)驗(yàn)中使用 100 ng/mL 的 TNF-α，持續(xù)24 小時(shí)。與 si-NC 組相比，敲低 SNHG8 導(dǎo)致 IL-1β、IL-6 和 IL-8 mRNA 水平上調(diào)，而 SNHG8 的過表達(dá)下調(diào)了這些炎癥因子（圖2 D）。Western blot 分析證實(shí)，敲低 SNHG8 可提高 phos-p65 蛋白水平并促進(jìn) IκBα 蛋白的降解，而過表達(dá) SNHG8 可降低 phos-p65 蛋白水平并逆轉(zhuǎn) IκBα 蛋白的降解（圖2 E）。這表明，SNHG8 抑制 PDLCs 中的 NF-κB 信號(hào)通路。

圖2 SNHG8 抑制 PDLCs 中的 NF-κB 信號(hào)通路。

用針對(duì) SNHG8 的小干擾 RNAs（si-SNHG8）、siRNA 對(duì)照（si-NC）和含有全長(zhǎng) SNHG8（SNHG8）的重組熒光標(biāo)記慢病毒以及對(duì)照（NC）轉(zhuǎn)染細(xì)胞，以敲低或過表達(dá)其表達(dá)。（A）熒光顯微鏡顯示 NC 組和 SNHG8 組 PDLC 的轉(zhuǎn)染效率。（B）qRT-PCR結(jié)果顯示SNHG8敲低組和過表達(dá)組的相對(duì)SNHG8表達(dá)。（C）qRT-PCR結(jié)果顯示TNF-α刺激后IL-1β、IL-6和IL-8的mRNA表達(dá)。（D）qRT-PCR結(jié)果顯示，在TNF-α刺激下，SNHG8被敲低或過表達(dá)后，IL-1β、IL-6和IL-8的相對(duì)RNA表達(dá)。（E）蛋白質(zhì)印跡分析顯示 SNHG8 敲低或過表達(dá)對(duì) PDLCs 中 TNF-α 誘導(dǎo)的 NF-κB 通路激活的影響。

然后，為了研究 SNHG8 調(diào)控 NF-κB 通路的機(jī)制，采用 SNHG8 載體轉(zhuǎn)染后進(jìn)行 RNA 測(cè)序。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，SNHG8 過表達(dá)組有820個(gè) mRNAs 表達(dá)差異。GO富集分析表明，改變的 mRNAs 在細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)中富集。qRT-PCR 顯示，兩組 SNHG8 幾乎完全定位于細(xì)胞核，提示 SNHG8 在細(xì)胞核中起作用。qRT-PCR 驗(yàn)證了受 HIF-1 調(diào)控的下游靶基因 AQP1、RORA、RGCC、VEGFA、PTGIS 和 PPARGC1A 這6個(gè)基因在 SNHG8 過表達(dá)組中的表達(dá)下調(diào)。此外，HIF-1α 激動(dòng)劑二甲基草酰甘氨酸（DMOG）逆轉(zhuǎn)了 SNHG8 對(duì) HIF-1 下游靶基因的抑制作用，表明 SNHG8 通過與 HIF-1α 相互作用來阻止 HIF-1 介導(dǎo)的下游靶基因激活。

根據(jù) RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)假設(shè) SNHG8 與 HIF-1α 結(jié)合，并通過 CatRAPID 證實(shí)了 SNHG8 和 HIF-1α 之間的相互作用，相互作用強(qiáng)度為 95%，表明 SNHG8 與 HIF-1α 特異性結(jié)合。

最后，為了確定 SNHG8 對(duì) NF-κB 通路的調(diào)節(jié)作用是否具有 HIF-1α 依賴性，實(shí)驗(yàn)在壓縮力負(fù)荷后敲低 SNHG8，并使用 HIF-1α 抑制劑 YC-1 下調(diào) HIF-1α。此外，在過表達(dá) SNHG8 后，使用 HIF-1α 激動(dòng)劑 DMOG 上調(diào) HIF-1α。Western blotting 顯示施加機(jī)械力后，100 μM 的 DMOG 導(dǎo)致 HIF-1α 的最大上調(diào)（圖3 A），100 μM 的 YC-1 抑制 HIF-1α 的積累（圖3 B）。Western blot 分析證實(shí)，敲低 SNHG8 會(huì)增加 NF-κB 通路的激活，而抑制 HIF-1α 則逆轉(zhuǎn)了這些作用（圖3 C）。SNHG8 的過表達(dá)降低了 NF-κB 通路的活性，然而，補(bǔ)充 HIF-1α 逆轉(zhuǎn)了這種效應(yīng)（圖3 D）。這些結(jié)果表明，SNHG8 以 HIF-1α 依賴性方式調(diào)控 NF-κB 通路。

圖3 SNHG8對(duì)NF-κB通路的影響取決于HIF-1α。

（A）DMOG刺激后PDLC中HIF-1α的蛋白質(zhì)印跡分析。（B）在PDLC中施加力和YC-1刺激后HIF-1α的蛋白質(zhì)印跡分析。（C）有或沒有SNHG8敲低，有或沒有YC-1刺激下施加壓縮力后phos-p65和IκBα的蛋白質(zhì)印跡分析。（D）有或沒有 SNHG8 過表達(dá)，有或沒有 DMOG 刺激下在 PDLC 中施加壓縮力后 phos-p65 和 IκBα 的蛋白質(zhì)印跡分析。

圖4 示意圖顯示，在 PDLCs中，SNHG8 與 HIF-1α 結(jié)合，并在正畸壓縮力下顯著下調(diào)。功能性 HIF-1α 增加以促進(jìn)下游轉(zhuǎn)錄活性，從而激活 NF-κB 通路。

總之，該研究結(jié)果表明，正畸力在體內(nèi)和體外誘導(dǎo)缺氧和炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致 HIF-1α 穩(wěn)定和 NF-κB 激活。SNHG8 與 HIF-1α 結(jié)合，并在 OTM 期間顯著下調(diào)。游離功能性 HIF-1α 被釋放以促進(jìn)轉(zhuǎn)錄活性，從而激活 NF-κB 通路（圖4）。這些發(fā)現(xiàn)表明了 OTM 中組織重塑的調(diào)控機(jī)制。

參考文獻(xiàn)：Wang C, Yang Q, Han Y, Liu H, Wang Y, Huang Y, Zheng Y, Li W. A reduced level of the long non-coding RNA SNHG8 activates the NF-kappaB pathway by releasing functional HIF-1alpha in a hypoxic inflammatory microenvironment. Stem Cell Res Ther. 2022 Jun 3;13(1):229. doi: 10.1186/s13287-022-02897-x. PMID: 35659362; PMCID: PMC9166574.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35659362/或點(diǎn)擊閱讀原文

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