新藥研發(fā)中抗體藥物的體外活性分析方法

新藥研發(fā)是一個長周期、高投資、高風險的過程。一款新藥在進入臨床試驗之前，非臨床階段的深入、系統(tǒng)研究至關(guān)重要。臨床前藥理藥效是其中的核心環(huán)節(jié)，藥效研究涉及藥物的基本類型、作用機制、選擇性、量效關(guān)系等方面。

 

體外藥效評價

抗體藥物的活性測定是對藥物的有效性和藥物效價的測定，是抗體藥物評價體系中至關(guān)重要的部分�？贵w藥物的體外活性分析方法分為兩類:抗原結(jié)合能力測定和生物學活性測定�？乖�結(jié)合能力測定常用的方法有ELISA法、流式細胞法等;生物學活性測定包括ADCC/ADCP/CDC檢測試驗、細胞增殖抑制、殺傷活性、凋亡以及細胞因子釋放試驗等

 

抗原結(jié)合能力測定

目前研發(fā)生產(chǎn)中主要通過測定抗體的抗原結(jié)合能力來評價活性，常用的方法有ELISA法和流式細胞儀法。

 

免疫測定法通常用于確定通過雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的單克隆抗體的同型。人們越來越需要高效、靈敏的檢測方法來確定這些單克隆抗體的同型。進行免疫測定最常用的技術(shù)是ELISA，ELISA是一種經(jīng)過時間驗證的方法，但需要多個耗時的步驟，可能導致數(shù)據(jù)的準確性受到影響。AlphaLISA是一種化學發(fā)光均質(zhì)微珠技術(shù)，不需要洗滌或分離步驟，因此與ELISA相比具有顯著優(yōu)勢。

 

AlphaLISA檢測通常在96孔或384孔板上進行，樣品體積低至5μL，減少有價值待測樣品的消耗�？倷z測時間小于3小時，是最常用ELISA檢測時間的一半。在此，我們報告了使用自動化開發(fā)幾種新的AlphaLISA檢測方法來檢測雜交瘤中產(chǎn)生的人IgG單克隆抗體的同型。

 

文獻來源：Use of the JANUS Automated Workstation to Develop Efficient AlphaLISA Immunoassays for Isotyping Human Monoclonal Antibodies

 

生物活性測定

 

ADCC抗體介導細胞毒性

單克隆抗體藥物是目前藥物研發(fā)的新熱點，與小分子藥物相比，抗體類藥物具有高效、低毒、半衰期長等特點�？贵w介導細胞毒性（ADCC）是引起抗體類藥物不良反應(yīng)的一個關(guān)鍵限制因素。Lazar G. A. 等人在建立了以Alpha技術(shù)競爭性驗證抗體Fc片段突變體與FcɤRs親和力檢測的體系，對計算機模擬設(shè)計出的上百種突變體，進行快速、高效的特異性檢測，以發(fā)現(xiàn)特異性更高、副作用更小的單克隆抗體藥物。

 

Binding of Fc variant Abs to FcγRs measured by competition AlphaScreen. Binding of alemtuzumab Fc variants to human V158 (Left) and F158 (Right) FcγRIIIa.
 

 

Alpha技術(shù)，是基于一對微珠的均相親和檢測方法，是一種非放射性、均相、可代替?zhèn)鹘y(tǒng)繁瑣ELISA技術(shù)的高效檢測方法，并可直接檢測血清、血漿或細胞裂解液等復雜生物樣品。Alpha檢測須配置高強度的激光光源，以激發(fā)出供體微珠上足量的單體氧分子。單體氧分子和受體微珠發(fā)生級聯(lián)化學反應(yīng)釋放出光子。該檢測光信號為化學發(fā)光，雖背景低，但源信號強度較熒光弱，因此需要配置超靈敏PMT以達到更好的檢測效果。Revvity EnSight多模式酶標儀具有超靈敏HTS Alpha 模塊在配置激光光源和超靈敏PMT的基礎(chǔ)上，又對光源和PMT進行了優(yōu)化，因此其信噪比更高、檢測速度更快。

 

細胞活力檢測

ATP（三磷酸腺苷）是細胞活性的標志物，其僅存在于具有代謝活性的細胞內(nèi)。因為細胞經(jīng)歷壞死或凋亡時，ATP濃度會迅速下降，所以ATP是監(jiān)測細胞毒性、殺傷、抑制和增殖的一種很好的指示劑。

 

免疫細胞介導的特異性殺傷

 

在腫瘤免疫療法的開發(fā)中，無論是有效性還是安全性評價，還是進一步的抗體機制如ADCC等研究，都離不開檢測免疫細胞介導的特異性殺傷。與直接的細胞活力檢測不同，基于免疫細胞的殺傷是細胞-細胞相互作用的結(jié)果，因此，對應(yīng)的檢測方法必須能夠特異區(qū)別靶細胞（腫瘤細胞）和效應(yīng)細胞（免疫細胞）。針對區(qū)分的需求，目前有多種檢測方法，例如51Cr釋放法，DELFIA EuTDA細胞毒法和螢火蟲報告基因法等。

 

化學發(fā)光的檢測信號是酶促反應(yīng)過程中釋放的光子，檢測時不需要外界激發(fā)光激發(fā)，也因此不會觸發(fā)環(huán)境中的自發(fā)背景熒光，所以化學發(fā)光檢測背景干凈、信噪比很高。但由于化學發(fā)光自身的發(fā)光特點，在同等條件下，化學發(fā)光的原始光子強度遠低于熒光強度檢測，所以化學發(fā)光需要獨立于熒光之外的超敏感檢測模式，放大檢測光子信號、減少空間串擾，才能在實驗中得到更好的檢測窗口和信噪比。

 

CAR-T殺傷效果檢測

 

CAR-T細胞的殺傷活性可通過對靶細胞裂解程度來檢測。與51Cr釋放法形式類似， DELFIA EuTDA細胞毒法利用熒光放大配體BATDA特異的標記靶細胞。

 

BATDA加入到細胞培養(yǎng)基中，可以穿過細胞膜，被胞內(nèi)酯酶裂解成TDA，TDA不能再穿過細胞膜。裂解標記的靶細胞在上清液中釋放TDA，然后轉(zhuǎn)移到實驗板上，與銪溶液結(jié)合生成熒光分子EuTDA。細胞裂解導致EuTDA的增加，因此增加的信號與標記的靶細胞死亡相關(guān)。除了靈活性和支持高通量特異性殺傷檢測外，DELFIA EuTDA細胞毒法具有TRF技術(shù)帶來的高穩(wěn)定性和重復性等優(yōu)勢，已成為主流的細胞殺傷檢測技術(shù)。

 

此外，TILs能夠殺傷腫瘤細胞，因此檢測TILs效率的重要指標之一檢測對腫瘤細胞的殺傷能力，Revvity公司能夠提供基于TRF技術(shù)DELFIA EuTDA檢測法。與51Cr釋放法形式類似， DELFIA EuTDA細胞毒法利用熒光放大配體BATDA特異的標記靶細胞。BATDA能迅速進入細胞，并在水解作用下形成親水的TDA留在細胞內(nèi)，并在靶細胞裂解下釋放，和DELIFAEu試劑相結(jié)合形成強熒光、穩(wěn)定的螯合物EuTDA用于檢測。除了靈活性和支持高通量特異性殺傷檢測外，DELFIA EuTDA細胞毒法具有TRF技術(shù)帶來的高穩(wěn)定性和重復性等優(yōu)勢，已成為主流的細胞殺傷檢測技術(shù)。

 

細胞因子檢測

 

細胞因子是免疫反應(yīng)過程中關(guān)鍵的信號轉(zhuǎn)導蛋白，通常為小于80kDa的多肽。在免疫系統(tǒng)內(nèi)部和其與宿主組織細胞的交流中，細胞因子占據(jù)基礎(chǔ)而又重要的地位。細胞因子的種類非常多樣，并能通過旁分泌和自分泌的形式調(diào)控廣泛的免疫功能。針對常見的重要細胞因子和分泌蛋白靶點，Revvity具有HTRF，ALPHA和LANCE技術(shù)平臺，可提供支持免洗的高通量篩選解決方案。相較于傳統(tǒng)的ELISA，這些技術(shù)具有更出色的靈敏度和動態(tài)范圍，提升了抗干擾能力的同時極大簡化了操作步驟。