mosquito應(yīng)用:基于Illumina測序平臺的DNA文庫構(gòu)建微縮化

簡介
近年來二代測序技術(shù)發(fā)展迅速，以其高通量、低成本的優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究中。對于高通量測序核心平臺而言，測序技術(shù)的發(fā)展使得文庫構(gòu)建流程面臨更低交付成本及更快交付速度的挑戰(zhàn)，而自動化液體處理工作站的出現(xiàn)緩解了這一瓶頸。本文闡述了mosquito HV如何成功完成基于Illumina測序平臺的DNA文庫構(gòu)建微縮化，體積僅為手動標(biāo)準(zhǔn)流程的十分之—。
mosquito HV是英國SPT Labtech公司研發(fā)生產(chǎn)的自動化液體工作站，采用獨(dú)特的固相置換技術(shù)，一次性槍頭內(nèi)的不銹鋼活塞直接與液體接觸，通過控制活塞的移動來進(jìn)行移液（圖1)。因此，mosquito可以對低至25nl的液體進(jìn)行精準(zhǔn)移液，無需進(jìn)行槍頭校準(zhǔn)和液體定義。
之所以選擇NEBNext Ultra II FS DNA方法， 是因?yàn)樗�使用酶切打斷�?shí)現(xiàn)片段化，無需進(jìn)行物理超聲打斷。使用ZymoBIOMICS 微生物群落標(biāo)準(zhǔn)品作為基因組DNA, 在使用不同起始量的input DNA情況下，將mosquito HV制備的微縮化文庫與手動制備的標(biāo)準(zhǔn)體積文庫進(jìn)行比較。為了確定樣本起始量較低時的結(jié)果，則使用單個菌株樣品的微縮化NEBNext Ultra II FS DNA文庫，和相同條件下手動制備的Illumina TruSeq Nano文庫進(jìn)行比較。此外還對NEBNext Ultra II FS DNA自動化建庫與TruSeqNanoh、TruSeq PCR Free手動或傳統(tǒng)工作站建庫進(jìn)行比較。  
手動 VS 自動建庫
本次實(shí)驗(yàn)以ZymoBIOMICS微生物群落標(biāo)準(zhǔn)品(Cat. No. D6306)為樣本，測試NEBNext Ultra II FS DNA文庫試劑盒。該標(biāo)準(zhǔn)品包含10種微生物菌種的基因組DNA混合物，目前被廣泛用于宏基因組學(xué)工作流程的驗(yàn)證和質(zhì)量控制， 它能反映實(shí)驗(yàn)過程中可能出現(xiàn)的偏差和錯誤，是測試文庫構(gòu)建試劑盒的理想工具。此外，它還可以直接與CGR先前測試過的建庫試劑盒進(jìn)行性能比較。測試起始量分別為50ng、1ng、0.1ng, 一式三份。  
臨床與細(xì)菌分離物的性能比較
使用ZymoBIOMICS微生物群落DNA標(biāo)準(zhǔn)品得出了令人滿意的分析結(jié)果，但這并不代表使用實(shí)際樣本可以達(dá)到同樣效果。此前曾手動制備TruSeqNano文庫，使用100ng的input DNA,從臨床分離的細(xì)菌樣本中生成數(shù)據(jù)�，F(xiàn)使用自動化平臺，縮減樣本量至1/10, 在NEBNext Ultra II FS DNA加入10ng DNA,井對結(jié)果進(jìn)行比較。       此前，CGR的工作流程使用的是Illumina TruSeq Nano 或TruSeqPCR Free建庫。使用上述方法（原始體系的手動及貝克曼FXP自動化系統(tǒng)）獲得數(shù)據(jù)。TruSeq Nano 或TruSeq PCR Free文庫分別使用了100ng和1µg的ZymoBIOMICS微生物群落DNA標(biāo)準(zhǔn)品。當(dāng)將50ng DNA 投入到1/10體積的NEB NEBNext Ultra II FS 進(jìn)行DNA 文庫構(gòu)建時，三種方法的數(shù)據(jù)具有可比性。
 
結(jié)論
本研究表明，NEBNext Ultra II FS DNA文庫以1/10體系制備，其性能不亞于人工制備的原始體系文庫，且通過反應(yīng)體系的微縮化大幅節(jié)約了試劑成本。重復(fù)率、對比率、覆蓋度和GC偏差（未在本文呈現(xiàn)）都與加入1ng DNA的情況下相當(dāng)。整個工作流程可以在一天內(nèi)完成，從而使樣本量更多的大型項(xiàng)目得以運(yùn)行，并有效減少技術(shù)誤差。
 
SPT Labtech
SPT Labtech是生命科學(xué)領(lǐng)域自動化儀器及耗材設(shè)計與開發(fā)的國際制造商。中國總部位于上海，專注于服務(wù)蓬勃發(fā)展的中國生命科學(xué)研究事業(yè)。