生物制品中核酸殘留的去除方法

近年來，生物制品在市場中所占比重越來越大，與之俱來的生物安全性問題也隨之而來。我國參照WHO、FDA和歐盟的標準，在藥典中明確規(guī)定酵母、大腸桿菌表達的生物制品中的DNA殘留量不超過10ng/劑，CHO和vero細胞表達的EPO、狂犬疫苗、乙肝疫苗等不超過100或10pg/劑。

生物制品的核酸殘留去除主要集中在病毒疫苗生產(chǎn)、重組蛋白藥物純化、細胞治療和疫苗研究中緩解PBMC細胞結團以及慢病毒的大規(guī)模純化等。
 

一，病毒疫苗生產(chǎn)

疫苗的使用者是健康人，并且許多疫苗已用于嬰幼兒。因此，藥品監(jiān)管機構應更加注意生物產(chǎn)品的安全性，尤其是殘留DNA和RNA的質量控制�，F(xiàn)階段病毒疫苗純化主要是采用凝膠滲透色譜法。但是，疫苗中殘留的Vero細胞DNA經(jīng)常超過規(guī)定的最低限度。Li Si-Ming等在2014年發(fā)表的文獻中指出，全能核酸酶能夠有效去除疫苗中殘留的宿主細胞DNA。經(jīng)過核酸酶的病毒疫苗，再用離子交換層析的方法進行純化，可以將疫苗中的核酸殘留量降到限值以下，并且顯著提高了生產(chǎn)回收率。Komatsu Y等的研究表明，全能核酸酶處理對病毒的感染效率無顯著影響。
 

 

 

圖2. 經(jīng)過核酸酶處理的樣品，殘留量降至100pg/mL以下

 

圖3. 核酸酶的處理對病毒感染效率無顯著影響

二，重組蛋白藥物殘留核酸去除
在傳統(tǒng)的放化療治療的局限下，重組蛋白藥物逐漸成為腫瘤治療領域的研究熱點。為了臨床治療的需要，重組蛋白產(chǎn)品的使用劑量已從微克增加到毫克或甚至是克，并且大多數(shù)生物制品需要長期重復給藥。目前的重組蛋白藥物主要來源于CHO細胞，細胞經(jīng)過常規(guī)的14天反應器fed-batch培養(yǎng)，密度最高可以達到3×107個/mL。因此，重組蛋白藥物中的核酸殘留去除極為重要。

三，防止細胞結團
從全血中分離出的外周血單核細胞(PBMC)，在細胞治療和疫苗研究中有重要應用，但是，冷凍PBMC（特別是從儲存的血液中提取的PBMC）解凍時容易成團，阻礙進一步分析。2015年，Lin D等人制定的protocol中明確說明，在PBMC解凍緩沖液中加入全能核酸酶，可以有效防止細胞成團，從而實現(xiàn)PBMC的冷凍保存，該方法被廣泛用于疫苗評估和CAR-T細胞療法研究中PBMC細胞的復蘇。

四，慢病毒的大規(guī)模純化
慢病毒介導的基因治療和細胞治療將會很快成為不僅是罕見遺傳病，也會是血液腫瘤、HIV等感染性疾病的常規(guī)治療方法。可擴大的慢病毒生產(chǎn)工藝的改進變得越來越迫切。除了載體的滴度及產(chǎn)量，對于慢病毒批次更關心的指標主要是各種污染物的去除。如下圖，在工業(yè)化生產(chǎn)領域，慢病毒大規(guī)模純化的常用步驟包括：用膜過濾澄清，隨后用切向流過濾/超濾或者體積排阻色譜來濃縮。所有機構的病毒純化流程中都采用了全能核酸酶來降低細胞殘留的以及質粒來源的DNA污染。

 

圖4. 不同公司/研究所采用的慢病毒大規(guī)模純化步驟中均含有全能核酸酶處理步驟

表1. 3種不同級別UCF.METM核酸酶質檢結果

 

注：檢測并合格（√）；無檢測該指標（-）；

五，逐典Pannarase全能核酸酶優(yōu)勢：

1.無動物源性、無氨芐青霉素

2.杰出單位比酶活、更高效的核酸降解能力

3.先進的生產(chǎn)工藝，非傳統(tǒng)His標簽純化、排除引入金屬離子風險

4.嚴格的質控標準，內(nèi)毒水平低，確保單位酶活的準確性以及批次間穩(wěn)定性

1，全能核酸酶應用條件：

全能核酸酶的酶活會受到多種因素的影響（例如溫度、pH、離子強度等），故用量范圍也會從0.1 U/mL-250 U/mL不等。因此，不同的操作環(huán)境下酶的最佳濃度不同，需要通過實驗設置梯度進行最佳條件的摸索。

2，應用實例：

1.樣品：狂犬病毒濃縮液

處理條件:核酸酶濃度50~90U/ml ,

37 ℃處理 2 h,轉入18 ~ 26 ℃處理 6h

2.樣品：狂犬病病毒濃縮液

處理條件：25、50和100 U/ml，37℃

 

3.樣品：流感病毒濃縮液

處理條件：10 U/mL，37℃