測(cè)定血清中21種元素的前處理方法研究

目的:采用電感耦合等離子體質(zhì)譜技術(shù)，測(cè)定血清中21種元素含量，重點(diǎn)優(yōu)化血清中多元素測(cè)定的樣品前處理方法。

方法:采用1%硝酸，1% TtitonX-100，0.01%吡咯二硫代氨基甲酸銨與1%乙醇混合溶劑稀釋血清樣品20倍后，進(jìn)入ICP-MS 儀器檢測(cè) Mn、Co、Ni、Cd、La、Ce、W、Hg、Tl、Mo、Sb、Fe、Cu、Zn、Se、Al、As、Sr、Pb、Sn 和 Cr 21 種元素的含量。

結(jié)果:血清中21種元素在線性范圍內(nèi)線性良好（r＞0.995）；檢出限為0.14～15.90μg/L。方法用于孕婦血清樣本檢測(cè)，低高濃度2個(gè)水平的血清加標(biāo)回收率為82.2%～121.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。采集639名孕婦血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，21種元素中除Tl、W、La、Ce、Hg ，其余元素均有檢出。

結(jié)論:通過(guò)條件優(yōu)化，采用混合溶劑稀釋法聯(lián)合ICP-MS對(duì)血清中21種金屬元素分析，方法快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，適宜用于評(píng)估人體元素暴露水平。

目前發(fā)現(xiàn)的金屬元素有80余種，人體中含有60余種，其中占人體總質(zhì)量0.01%的微量元素有20余種如鐵、銅、鋅、鈷、錳、鉻、硒、鎳、鉬、錫等，雖然在人體內(nèi)的含量較低，但它們是構(gòu)成細(xì)胞結(jié)構(gòu)必不可少的成分，在人體代謝和生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用；還有一些重金屬元素不是生命活動(dòng)所必須，且超過(guò)一定濃度都對(duì)人體有毒如鎘、鉛、砷、汞等。人體可通過(guò)食品、飲水、空氣等攝入元素，為了準(zhǔn)確高效的監(jiān)測(cè)人體元素暴露水平，評(píng)估其健康效應(yīng)，建立血清中多元素同時(shí)分析方法是必要的。

雖然目前多元素檢測(cè)的方法已較成熟，在常用的原子吸收分光光度法、原子熒光光譜法、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法和電感耦合等 離子體質(zhì)譜法（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）中，ICP-MS法的寬線性范圍、高靈敏度和強(qiáng)抗干擾能力，使其在多元素分析中具有不可比擬的優(yōu)勢(shì)，應(yīng)用范圍越來(lái)越廣，尤其 在生物樣品檢測(cè)中，ICP炬焰的超高溫，使得樣品經(jīng)簡(jiǎn)單處理也能獲得滿意的效果。不同的元素在體內(nèi)的存在形態(tài)不同，溶出所需條件亦有差異，雖已有
ICP-MS測(cè)定血清元素的諸多報(bào)道，但筆者在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，樣品前處理的不同會(huì)帶來(lái)極大的影響，要兼顧各元素分析，獲得靈敏準(zhǔn)確的結(jié)果尚屬不易。因此本文通過(guò)重點(diǎn)優(yōu)化血清樣品前處理?xiàng)l件，選擇21種常見金屬元素進(jìn)行ICP-MS分析，構(gòu) 建出一種快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方式，并用于孕婦血清樣品的批量分析。

材料與方法
材料: 樣品來(lái)源于臨床檢驗(yàn)樣品，血樣采集后進(jìn)行血清分離，將血清分裝并放入凍存盒中，于－80 ℃冰箱保存。
儀器: 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀
標(biāo)準(zhǔn)品和試劑：購(gòu)自國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心的21種待測(cè)元素標(biāo)準(zhǔn)溶液⁵⁵ Mn、⁵⁹ Co、⁶⁰ Ni、¹¹¹ Cd、¹³⁹ La、¹⁴⁰ Ce、¹⁸² W、²⁰¹ Hg、²⁰⁴ Tl、⁹⁶ Mo、¹²² Sb、⁵⁶ Fe、⁶⁴ Cu、⁶⁶ Zn、⁷⁸ Se、²⁷ Al、⁷⁵ As、⁸⁸ Sr、²⁰⁸ Pb、¹¹⁸ Sn和⁵² Cr，濃度1000μg/mL。
5種內(nèi)標(biāo)元素標(biāo)準(zhǔn)溶液：⁴⁵ Sc、⁷² Ge、¹¹⁵ In、¹⁵⁹ Tb和²⁰⁹ Bi，自國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心購(gòu)入，濃度為1000μg/mL。
硝酸（BV-III 級(jí)），購(gòu)自北京化學(xué)試劑研究所。Triton X-100（LR級(jí)），購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。乙醇和四甲基氫氧化銨均為分析純。

實(shí)驗(yàn)方法
ICP-MS儀器條件：通過(guò)自動(dòng)調(diào)諧和優(yōu)化，確定ICP-MS 條件為：射頻功率1550W，載氣流速 1.05 L/min，采樣深度 8.0mm，霧化器泵速 0.10rps， 霧化室溫度2℃，提取透鏡－200.0V；四級(jí)桿偏轉(zhuǎn)電 壓－3.0V；八級(jí)桿射頻功率150 V，能量歧視5.0V。 各元素均選擇He模式進(jìn)行測(cè)定，八級(jí)桿碰撞池He 氣流速1.0L/min。

樣品稀釋劑配制：實(shí)驗(yàn)采用1%硝酸（BV Ⅲ級(jí)）溶液，1%TtitonX-100溶液，0.01%吡咯烷二硫 代氨基甲酸銨與 1%乙醇混合作為樣品稀釋劑。 具體配制方法：以配制 1 000mL稀釋劑為例，加入 硝酸10mL，曲拉通 X-100 0.5g，吡咯烷二硫代氨 基甲酸銨 0.10g，乙醇 10mL，用純水溶解并定容至 1000mL，充分混勻后置4 ℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線制定 參考21種元素在血清中的濃度，分為3個(gè)濃度系列配制標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液，其中Mn、Co、Ni、Cd、La、Ce、W、Hg、Tl、Mo 和Sb為同一系列濃度，元素應(yīng)用液濃度為40 μg/L； As、Sr、Pb、Sn、Cr為同一系列濃度，元素應(yīng)用液濃度為100 μg/L；Fe、Cu、Zn、Se和Al為同一系列濃度，元素應(yīng)用液濃度為1000μg/L。分別吸取混合標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液 0μL、50μL、100 μL、200μL、500μL、1000μL，定容至10mL，配制成標(biāo)準(zhǔn)系列濃度：Mn、Co、Ni、Cd、La、Ce、W、Hg、Tl、Mo 和 Sb 標(biāo)準(zhǔn)系列濃度為0μg/L、0.20 μg/L、0.40 μg/L、0.80 μg/L、2.00 μg/L、4.00 μg/L；As、Sr、Pb、Sn和Cr標(biāo)準(zhǔn)系列濃度為0 μg/L、0.50 μg/L、1.00 μg/L、2.00 μg/L、5.00 μg/L、10.00 μg/L；Fe、Cu、Zn、Se 和 Al 標(biāo) 準(zhǔn) 系 列 濃 度 為 0 μg/L、5.00 μg/L、10.00 μg/L、20.00 μg/L、50.00 μg/L、100.00μg/L。

將上述標(biāo)準(zhǔn)系列溶液注入ICP-MS中進(jìn)行分析，以各待測(cè)元素濃度為橫坐標(biāo)，各待測(cè)元素與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)元素的響應(yīng)值比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。選擇與待測(cè)元素原子量接近的內(nèi)標(biāo)進(jìn)行相應(yīng)的校正。

方法學(xué)驗(yàn)證 從靈敏度（檢出限）、精密度（相 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差）和準(zhǔn)確度（回收率）3方面進(jìn)行方法學(xué) 驗(yàn)證，以考察方法性能，數(shù)據(jù)分析通過(guò) Excel 2007 進(jìn)行計(jì)算。通過(guò)平行測(cè)定混合血清10次，以測(cè)定值 的 3 倍和 10 倍標(biāo)準(zhǔn)差對(duì)應(yīng)的濃度計(jì)算檢出限 （LODs）和定量限（LOQs）；吸取混合血清樣品9份， 其中3份用于測(cè)定本底值，另取6 份分別加入定量 限和 2倍定量限水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在 1日內(nèi)重復(fù)測(cè)定6次和6日內(nèi)重復(fù)測(cè)定21種元素的含量，計(jì)算測(cè) 得值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值（RSDs）和加標(biāo)回收率。

樣品分析采集血樣后分離血清，將血清分裝于0.5mL離心管內(nèi)，編號(hào)并放入凍存盒內(nèi)，－80 ℃冰 箱保存。實(shí)驗(yàn)前取出于室溫下解凍。吸取100μL血清樣品于5mL塑料離心管中，加入稀釋劑：1%硝酸 （BV Ⅲ級(jí)）溶液，1%TtitonX-100溶液，0.01%吡咯烷 二硫代氨基甲酸銨與1%乙醇直接稀釋20倍，渦旋混勻，10 000 r/min離心2 min，取上清進(jìn)樣分析。質(zhì) 控血清以同樣方式進(jìn)行處理。

樣品分析的質(zhì)量控制 每批次上機(jī)前和每測(cè)30個(gè)樣品后進(jìn)行質(zhì)控檢測(cè)，包括程序空白、平行樣和質(zhì)控樣品。程序空白實(shí)驗(yàn)是指前處理過(guò)程中，除不加樣品外，其他步驟同1.3樣品分析，用于監(jiān)測(cè)整個(gè)實(shí)驗(yàn)分析階段中待測(cè)元素的干擾，若在進(jìn)樣液中檢出待測(cè)元素，則需排除原因后重新測(cè)定。平行樣指對(duì)同一血樣進(jìn)行相同的處理和分析，2次檢測(cè)結(jié)果差值應(yīng)不超過(guò)平均值的10%，否則需排除原因后重新分析。ClinChek微量元素質(zhì)控樣檢測(cè)，測(cè)得值與標(biāo)準(zhǔn)值的相對(duì)偏差均在參考值范圍內(nèi)。

ICP-MS 測(cè)定模式選擇 采用碰撞反應(yīng)模式（He）和標(biāo)準(zhǔn)模式（No gas）考察了ICP-MS的測(cè)定模式，通過(guò)加標(biāo)樣品分析，各元素在He模式下的回收率均優(yōu)于 No gas 模式，回收率在 80%～120%范圍內(nèi)。因此實(shí)驗(yàn)選擇在He模式下進(jìn)行測(cè)定。

樣品前處理方式優(yōu)化
直接稀釋法與微波消解法的比較 ICP-MS測(cè)定時(shí)常用的樣品前處理方式有微波消解法和直接稀釋法。消解法對(duì)有機(jī)物的消解能力強(qiáng)，能更有效降低樣品的基質(zhì)效應(yīng)，但操作相對(duì)繁瑣，消解過(guò)程中待測(cè)元素易受到污染和損失。ICP-MS采用超高溫的ICP炬焰，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行離子化的同時(shí)，也可使樣品基質(zhì)高溫下徹底灰化，因此一些液態(tài)樣品經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的處理如稀釋、過(guò)濾等，即可引入儀器進(jìn)行元素測(cè)定。實(shí)驗(yàn)比較了直接稀釋法和微波消解法的加標(biāo)樣品回收率，結(jié)果表明采用消解法，Al、Pb等元素空白值偏高（＞2.0 μg/L）且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差大（15%～30%），并且由于加熱趕酸會(huì)造成Hg元素?fù)p失，回收率偏低（低于70%）；直接稀釋法的元素回收率均較為理想（高于80%），空白可以得到有效控制。

因此，實(shí)驗(yàn)選擇直接稀釋法進(jìn)行樣品處理，并進(jìn)一步優(yōu)化了稀釋劑組合和稀釋倍數(shù)。稀釋劑選擇 稀釋溶劑一般使用水和一定濃度的硝酸，為了提高測(cè)定靈敏度，可加入非離子性表面活性劑或有機(jī)試劑如曲拉通X-100、乙醇，以及金屬絡(luò)合劑如吡咯烷二硫代氨基甲酸銨，同時(shí)防止未溶解的生物蛋白物質(zhì)堵塞 ICP-MS 霧化系統(tǒng)。與酸性稀釋劑相比，堿性稀釋劑如四甲基氫氧化銨，可減少酸度對(duì)ICP-MS的干擾，又可以快速消除記憶效應(yīng)。綜上，參考美國(guó)疾病預(yù)防控制中心測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)（DLS 3016.8. Blood Metals Panel 2 （BMP2）ICP-DRC-MS.）和中國(guó)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)（T/WSJD 19.1—2021，全血中 23 種元素的電感耦合等離子體質(zhì)譜法），實(shí)驗(yàn)擬采用 1%硝酸溶液、0.05%Triton-100、0.01%吡咯烷二硫代氨基甲酸銨、1.0%，v/v 四甲基氫氧化銨、1%乙醇作為稀釋溶劑，并采取以下4 種組合方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，選取最優(yōu)稀釋劑組合。方法①：四甲基氫氧化銨（1.0%，v/v）＋曲拉通 X-100（0.05%）＋吡咯烷二硫代氨基甲酸銨（0.01%）＋乙醇（1%，v/v）；方法②：曲拉通X-100（0.05%）＋吡咯烷二硫代氨基甲酸銨（0.01%）＋乙醇（1%，v/v）（色譜純?yōu)榧眩�＋硝酸�?.0%，v/v）；方法③：曲拉通 X100（0.05%）＋硝酸（1.0%，v/v）＋吡咯烷二硫代氨基 甲酸銨（0.01%）；方法④：曲拉通X-100（0.05%）＋硝 酸（1.0%，v/v）＋乙醇（1%，v/v）。

經(jīng)過(guò)幾種組合的比對(duì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，硝酸的加入可以顯著提高 Al、Ni 2 種元素的線性，以及Cu、Sn、La、Ce 的回收率（從＜60%增至＞75%），說(shuō)明這幾種元素在硝酸介質(zhì)中不易降解或沉淀?yè)p失，更易溶出；吡咯烷二硫代氨基甲酸銨加入可以顯著提高Sn、La、Ce的回收率（從＜40%增至＞88%），說(shuō)明吡咯烷二硫代氨基甲酸銨可提高這幾種元素的溶出；乙醇的加入可使得As的回收率好轉(zhuǎn)，且能有效提高大多元素的響應(yīng)值（1.1～1.5 倍）；四甲基氫氧化銨的添加會(huì)造成 Al、Cu、La、Ce 等元素回收率下降，可能是堿性條件下容易發(fā)生沉淀造成損失，對(duì)其余各元素影響甚小。綜合各元素回收率的情況，實(shí)驗(yàn)最終選取稀釋劑組合為：1%硝酸，0.05%TrtionX-100 溶液，0.01%吡咯二硫代氨基甲酸銨，1%乙醇。

稀釋倍數(shù) 隨機(jī)抽取10份血清樣品混合，優(yōu)化的稀釋劑，在10～30倍范圍內(nèi)對(duì)稀釋倍數(shù)進(jìn)行了考察。由于血清粘度較大、基質(zhì)較復(fù)雜，采用較低稀釋倍數(shù)時(shí)，容易堵塞進(jìn)樣毛細(xì)管，對(duì)部分元素尤其是樣品中低含量的元素分析產(chǎn)生干擾，使其測(cè)定的精密（＞20%）和回收率較低（40%～60%），但稀釋倍數(shù)太高又會(huì)導(dǎo)致一些元素分析靈敏度低。綜合考慮回收率和靈敏度，實(shí)驗(yàn)最終選擇血 清樣品稀釋20倍，離心后進(jìn)樣分析。

討論
檢測(cè)模式和樣品前處理方式 實(shí)驗(yàn)比較了 ICP-MS 在 2 種模式下（He模式/No Gas 模式）各種 元素的測(cè)定結(jié)果，考慮到元素的線性回歸以及加標(biāo) 回收率，在前者模式下各種元素有更好的結(jié)果呈現(xiàn)， 因此實(shí)驗(yàn)選擇了在He模式下進(jìn)行元素測(cè)定。這基于He模式可以有效消除多原子離子干擾，是ICP-MS測(cè)定的基本原理，在此不再贅述。 實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)考察了血清樣品前處理方式，采用 消解法與直接稀釋法對(duì)血清樣品進(jìn)行前處理。與 文獻(xiàn)報(bào)道一致，消解法可以徹底的除去血清中的 有機(jī)基質(zhì)，取得良好的回收率，但揮發(fā)性元素的揮 發(fā)損失、消解后的趕酸過(guò)程以及因趕酸不徹底帶來(lái)的酸度干擾，均會(huì)使操作更為繁瑣或降低方法的準(zhǔn)確度。