單細(xì)胞RNA測序及全外顯子組測序在甲狀腺癌去分化的綜合分析中的應(yīng)用

圖1 甲狀腺癌的單細(xì)胞特征

2. 甲狀腺癌去分化過程中轉(zhuǎn)錄水平的動態(tài)變化
為了深入了解PTC到ATC的細(xì)胞進(jìn)展，作者將PTC細(xì)胞分為PTC衍生的PTC細(xì)胞（pPTC）和ATC衍生的PTC細(xì)胞（aPTC）（圖2A）。細(xì)胞軌跡分析揭示了ATC和PTC具有不同的進(jìn)展途徑（圖2C）。aPTC細(xì)胞定位于ATC進(jìn)展軌跡上，并且它們中的一個(gè)子集在分叉后接近ATC細(xì)胞，表明ATC可能來源于PTC細(xì)胞的亞群（即aPTC）。沿著PTC到ATC細(xì)胞的軌跡，作者鑒定了許多參與癌癥發(fā)展的基因表達(dá)變化和多種癌癥相關(guān)途徑的不同激活。這些發(fā)現(xiàn)表明濾泡細(xì)胞進(jìn)展為PTC或ATC遵循不同的進(jìn)化途徑，涉及特定的細(xì)胞亞群和多個(gè)途徑的激活。
 

圖2甲狀腺癌去分化過程中的進(jìn)化軌跡和轉(zhuǎn)錄水平的變化

3. CNAs在甲狀腺癌去分化中的作用
為了鑒定ATC和PTC細(xì)胞之間基因組的差異，作者基于單細(xì)胞數(shù)據(jù)推斷拷貝數(shù)改變（CNA），在ATC細(xì)胞中鑒定出比PTC細(xì)胞中更高的CNA，表明ATC細(xì)胞中染色體不穩(wěn)定性增加（圖3A）。結(jié)合WES分析結(jié)果，作者鎖定了在三種ATC腫瘤中觀察到的Chr 11-CNA（41.1至47.9 M）（圖3B和圖3C）。氣泡圖顯示，與正常細(xì)胞和PTC細(xì)胞相比，位于該CNA區(qū)域的大多數(shù)基因在ATC細(xì)胞中高度表達(dá)（圖3C）。此外，該Chr 11-CNA在從正常細(xì)胞到ATC細(xì)胞的細(xì)胞軌跡的中途開始增加，并且在ATC細(xì)胞中高度富集，但在PTC細(xì)胞中不富集（圖3D），表明該區(qū)域中的特定基因可能參與aPTC的ATC進(jìn)展。
 

圖3 甲狀腺癌去分化過程中的CNAs

4. CREB3L1作為ATC中的主轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子
由于上述多種途徑與ATC進(jìn)展相關(guān)，作者推測上游轉(zhuǎn)錄因子（TF）可能是ATC進(jìn)展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。因此，作者用scRNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行SCENIC分析以重建共表達(dá)模塊并鑒定ATC進(jìn)展期間的關(guān)鍵TF調(diào)節(jié)劑。分析發(fā)現(xiàn)CREB3L1在ATC衍生的甲狀腺癌細(xì)胞中富集，特別是在ATC細(xì)胞中高表達(dá)，表明CREB3L1表達(dá)與ATC進(jìn)展相關(guān)。在ATC細(xì)胞中觀察到大量CREB3L1陽性細(xì)胞（圖4 B），并沿濾泡-aPTC-ATC軌跡逐漸富集（圖4C）。CREB3L1恰好位于上述ATC相關(guān)的Chr11-CNA中，為它在ATC進(jìn)展中的潛在作用提供了重要支持。為探究CREB3L1在ATC發(fā)展中的作用，作者進(jìn)一步研究了CREB3L1的靶基因及其在ATC中的相關(guān)通路。ChIP-seq分析結(jié)果顯示，CREB3L1的結(jié)合區(qū)在基因啟動子中高度富集（圖4 E），2222個(gè)基因被鑒定為CREB3L1的潛在靶標(biāo)，其表達(dá)傾向于沿著ATC進(jìn)展而增加（圖4F）。CREB3L1靶基因在ATC細(xì)胞中富集EMT和mTOR信號傳導(dǎo)（圖4G），與scRNA-seq中ATC轉(zhuǎn)錄組的通路富集分析一致。這些發(fā)現(xiàn)為CREB3L1通過EMT和mTOR途徑在ATC發(fā)展中的主轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用提供了強(qiáng)有力的支持。
 

5. 驅(qū)動的通路與甲狀腺癌進(jìn)展的相關(guān)性
對來自GEO數(shù)據(jù)庫的4項(xiàng)獨(dú)立的甲狀腺癌bulk RNA做GSEA分析，進(jìn)一步評估CREB3L1對ATC形成的影響。分析結(jié)果均顯示，CREB3L1和參與EMT/mTORC1途徑的基因在ATC中顯著富集（圖5A）。根據(jù)CREB3L1表達(dá)水平將來自TCGA的甲狀腺癌樣本分為兩組。在兩組之間總共鑒定了1115個(gè)DEGs，EMT相關(guān)基因在CREB3L1high組中高表達(dá)（圖5 B）。有趣的是，CREB3L1高表達(dá)可以預(yù)測TCGA中PTC患者的顯著更差的總體存活率（圖5E）。為了進(jìn)一步評估CREB3L1的功能，作者在PTC細(xì)胞系中過表達(dá)CREB3L1，其遷移能力顯著增加（P = 0.004）（圖5G），并誘導(dǎo)了多種EMT相關(guān)標(biāo)志物高表達(dá)，抑制與EMT負(fù)相關(guān)的E-鈣粘蛋白的表達(dá)（圖5 H）。此外，CREB3L1染色在其他癌癥的甲狀腺轉(zhuǎn)移中不存在（例如，肺腺癌、非霍奇金淋巴瘤和鱗狀細(xì)胞癌）。因此，CREB3L1免疫組化染色陽性有助于該病的鑒別診斷和指導(dǎo)臨床治療，這些發(fā)現(xiàn)表明CREB3L1表達(dá)可能決定甲狀腺癌的細(xì)胞命運(yùn)，并促進(jìn)甲狀腺癌患者的ATC進(jìn)展和不良臨床結(jié)局。
 

圖5 CREB3L1在甲狀腺癌進(jìn)展中的功能

參考文獻(xiàn)：
Luo H, Xia X, Kim GD, et al (2021) Characterizing dedifferentiation of thyroid cancer by integrated analysis. Sci Adv 7:eabf3657. https://doi.org/10.1126/sciadv.abf3657