Ecsit-EGFP報(bào)告基因小鼠在發(fā)現(xiàn)調(diào)控CD8+ T細(xì)胞記憶形成新機(jī)制中的應(yīng)用

CD8⁺記憶T細(xì)胞在機(jī)體抵御感染和癌癥中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，能夠建立強(qiáng)烈且快速的二次應(yīng)答反應(yīng)。目現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)一系列轉(zhuǎn)錄因子可以促進(jìn)CD8⁺記憶T細(xì)胞分化，包括TCF-1、BCL6、ID3和MYB等。其中以TCF-1為中心的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在CD8⁺記憶T細(xì)胞的產(chǎn)生中發(fā)揮關(guān)鍵核心作用。然而，影響TCF-1表達(dá)和活性的上游關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制以及這些調(diào)控對(duì)CD8⁺記憶T細(xì)胞形成和功能發(fā)揮的影響仍然未知。

2024年1月，南京醫(yī)科大學(xué)楊碩教授聯(lián)合王曦和陳蕓教授以及美國馬薩諸塞大學(xué)醫(yī)學(xué)院Fiachra Humphries教授合作在Nature cell biology發(fā)表題為ECSIT facilitates memory CD8⁺ T cell development by mediating fumarate synthesis during viral infection and tumorigenesis的研究論文。該研究揭示了ECSIT蛋白可作為記憶T細(xì)胞分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子TCF-1上游重要調(diào)控蛋白，在調(diào)控CD8⁺記憶T細(xì)胞形成和促進(jìn)機(jī)體持續(xù)免疫反應(yīng)力中發(fā)揮重要作用。

南京醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院已畢業(yè)博士（現(xiàn)工作于無錫市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科）楊勇兵和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院博士研究生王亞男為本文的共同第一作者，南京醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院楊碩教授、生殖醫(yī)學(xué)與子代健康全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室王曦教授、藥學(xué)院陳蕓教授和美國馬薩諸塞大學(xué)醫(yī)學(xué)院Fiachra Humphries教授為本文的共同通訊作者。
 

圖片來源：《Nature cell biology》
（https://doi.org/10.1038/s41556-024-01351-9）

研究材料與方法
在這項(xiàng)研究中，研究人員采用Ecsit-EGFP報(bào)告基因小鼠（賽業(yè)生物提供）研究ECSIT在不同免疫細(xì)胞和不同狀態(tài)的CD8⁺ T細(xì)胞的表達(dá)

研究方法
流式細(xì)胞術(shù)、RNA-seq、ATAC-Seq、ChIP-seq/qPCR、Western blotting、免疫熒光染色、Seahorse、代謝組學(xué)。

技術(shù)路線
01 ECSIT在CD8⁺記憶T細(xì)胞中高表達(dá)
02 病原刺激下，ECSIT促進(jìn)CD8⁺記憶T細(xì)胞分化和功能
03 ECSIT促進(jìn)TCF-1表達(dá)及轉(zhuǎn)錄調(diào)控進(jìn)而促進(jìn)CD8^＋記憶T細(xì)胞分化和功能
04 ECSIT缺失抑制富馬酸產(chǎn)生，促進(jìn)KDM5活性進(jìn)而抑制Tcf7的H3K4me3修飾

研究結(jié)果
1 ECSIT在CD8⁺記憶T細(xì)胞中高表達(dá)
作者通過分析公開數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)在穩(wěn)態(tài)、感染或者黑色素瘤小鼠中，ECSIT都在CD8⁺記憶T細(xì)胞中高表達(dá)。隨后作者通過構(gòu)建Ecsit-EGFP小鼠（賽業(yè)生物提供）對(duì)此結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果與數(shù)據(jù)庫分析一致。
 

ECSIT在CD8⁺記憶T細(xì)胞中高表達(dá)^[1]

2 ECSIT缺失抑制急性病毒感染下CD8⁺記憶T細(xì)胞分化
為了研究ECSIT對(duì)CD8⁺記憶T細(xì)胞形成的作用，并排除ECSIT在應(yīng)答早期對(duì)CD8⁺效應(yīng)T細(xì)胞的影響，作者構(gòu)建了ECSIT的Ecsit^fl/fl Rosa26^CreERT2 OT-1誘導(dǎo)型敲除小鼠。隨后將小鼠脾臟中的naïveCD8⁺T細(xì)胞以相同的數(shù)目分別靜脈注射到野生型受體鼠中，1天后對(duì)受體鼠注射VSV-OVA病毒感染。在感染后第21-25天對(duì)受體鼠腹腔注射他莫昔芬誘導(dǎo)ECSIT敲除，感染35天后檢測(cè)受體鼠OT-1記憶T細(xì)胞的變化。結(jié)果顯示CD8⁺記憶T細(xì)胞及記憶前體細(xì)胞的比例及數(shù)目在ECSIT缺失后顯著下降，并且促進(jìn)記憶T細(xì)胞形成的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)同樣降低。
 

ECSIT缺失抑制急性病毒感染下CD8⁺記憶T細(xì)胞分化^[1]

測(cè)序結(jié)果表明ECSIT缺失抑制CD8⁺記憶T細(xì)胞分化和Tcf7的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[1]

4 急性病原體刺激下，ECSIT缺失通過抑制富馬酸產(chǎn)生來促進(jìn)KDM5酶活性，進(jìn)而抑制TCF-1表達(dá)
測(cè)序發(fā)現(xiàn)ECSIT缺失顯著影響代謝相關(guān)通路，因此作者將體外誘導(dǎo)分化的記憶T細(xì)胞進(jìn)行LC-MS代謝組學(xué)分析。結(jié)果顯示富馬酸是ECSIT缺失后下降最為明顯的代謝物。鑒于富馬酸可以抑制組蛋白去甲基化酶KDM5酶活性，以及記憶T細(xì)胞TCF-1的啟動(dòng)子區(qū)域存在大量H3K4me3修飾位點(diǎn)，作者推測(cè)ECSIT是通過影響富馬酸產(chǎn)生來抑制KDM5酶活性，從而促進(jìn)TCF-1啟動(dòng)子區(qū)域H3K4me3修飾，促進(jìn)TCF-1表達(dá)調(diào)控，最終影響CD8⁺記憶T細(xì)胞分化。
 

ECSIT缺失通過抑制富馬酸產(chǎn)生來促進(jìn)KDM5酶活性，進(jìn)而抑制TCF-1表達(dá)^[1]

5 ECSIT缺失促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和CD8⁺ T細(xì)胞耗竭
接下來作者想探究ECSIT是否也能影響腫瘤中CD8⁺記憶T細(xì)胞的形成。因此作者對(duì)受體鼠進(jìn)行B16-OVA皮下荷瘤，第二日將小鼠脾臟中的naïve CD8⁺T細(xì)胞富集出來，1：1靜脈注射到受體小鼠體內(nèi)。第10-15天對(duì)受體鼠腹腔注射他莫昔芬誘導(dǎo)Ecsit敲除，之后檢測(cè)腫瘤生長和小鼠存活，及腫瘤微環(huán)境中OT-1細(xì)胞的變化。結(jié)果顯示ECSIT缺失顯著促進(jìn)了腫瘤生長，抑制腫瘤小鼠存活，同時(shí)腫瘤內(nèi)CD8⁺耗竭T細(xì)胞顯著增加，而干細(xì)胞樣耗竭前體細(xì)胞顯著減少。
 

ECSIT缺失促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和CD8⁺ T細(xì)胞耗竭[1]

6 ECSIT缺失抑制腫瘤慢性刺激下CD8⁺干細(xì)胞樣耗竭前體細(xì)胞基因表達(dá)和TCF-1轉(zhuǎn)錄調(diào)控
為探究ECSIT影響腫瘤微環(huán)境中CD8⁺干細(xì)胞樣耗竭前體T細(xì)胞分化和功能的具體機(jī)制，作者將移植20天的CD45.1受體鼠中的OT-1細(xì)胞分選出來進(jìn)行RNA和ATAC測(cè)序。結(jié)果顯示ECSIT缺失后，干細(xì)胞樣耗竭前體T細(xì)胞分化相關(guān)的基因表達(dá)及信號(hào)通路均顯著降低。聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，TCF-1是ECSIT影響CD8⁺干細(xì)胞樣耗竭前體T細(xì)胞分化最顯著的轉(zhuǎn)錄因子。
 

ECSIT缺失抑制CD8⁺干細(xì)胞樣耗竭前體細(xì)胞基因表達(dá)和TCF-1轉(zhuǎn)錄調(diào)控[1]

7 慢性刺激下，ECSIT缺失通過抑制富馬酸產(chǎn)生來促進(jìn)KDM5酶活性，進(jìn)而下調(diào)TCF-1表達(dá)
作者將體外慢性抗原刺激的OT-1細(xì)胞進(jìn)行LC-MS代謝組學(xué)分析。結(jié)果表明富馬酸同樣是ECSIT缺失后下降最為明顯的代謝物。KDM5酶活性測(cè)試、H3K4me3 ChIP-seq和富馬酸二甲酯（DMF）體內(nèi)外回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了ECSIT通過影響富馬酸產(chǎn)生來抑制KDM5酶活性，從而促進(jìn)TCF-1啟動(dòng)子區(qū)域H3K4me3修飾，促進(jìn)TCF-1表達(dá)調(diào)控，最終影響CD8⁺記憶T細(xì)胞分化的猜想。
 

ECSIT缺失通過抑制富馬酸產(chǎn)生來促進(jìn)KDM5酶活性，進(jìn)而下調(diào)TCF-1表達(dá)[1]

研究結(jié)論
綜上，該研究首次發(fā)現(xiàn)影響CD8⁺記憶T細(xì)胞分化核心轉(zhuǎn)錄因子TCF-1代謝表觀調(diào)控機(jī)制，同時(shí)發(fā)現(xiàn)進(jìn)化保守蛋白ECSIT在適應(yīng)性免疫CD8⁺記憶T細(xì)胞中的重要功能，揭示了富馬酸在抗腫瘤免疫聯(lián)合治療中的潛在應(yīng)用價(jià)值。

原文檢索：
[1]Yang Y, Wang Y, Wang Z, Yan H, Gong Y, Hu Y, Jiang Y, Wen S, Xu F, Wang B, Humphries F, Chen Y, Wang X, Yang S. ECSIT facilitates memory CD8⁺ T cell development by mediating fumarate synthesis during viral infection and tumorigenesis. Nat Cell Biol. 2024 Feb 7. doi: 10.1038/s41556-024-01351-9.