RT-RPA-PfAgo系統(tǒng)：一種快速靈敏的水稻感染病毒多重檢測(cè)方法

水稻被認(rèn)為是世界上重要的作物之一，由于無(wú)法獲得特定的抗病毒藥物，水稻病毒管理面臨重大挑戰(zhàn)，需要及早進(jìn)行田間檢測(cè)。目前，檢測(cè)水稻病毒的主要方法包括電子顯微鏡、血清學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)技術(shù)，如逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) (RT-PCR) 和實(shí)時(shí)熒光定量PCR。血清學(xué)方法雖然被廣泛使用，但往往靈敏度較低，導(dǎo)致頻繁的假陰性。電子顯微鏡和先進(jìn)的分子技術(shù)都需要專門昂貴的設(shè)備，如電子顯微鏡和熱循環(huán)儀，以及熟練的實(shí)驗(yàn)室人員，這限制了它們的廣泛應(yīng)用。

基于核酸診斷的出現(xiàn)引入了重組酶聚合酶擴(kuò)增 (RPA) 和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 (LAMP) 檢測(cè)等創(chuàng)新方法。這些測(cè)定通常使用專門設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行，以識(shí)別靶標(biāo)的獨(dú)特序列，在等溫條件下運(yùn)行，無(wú)需熱循環(huán)。特別是LAMP已被證明可有效識(shí)別各種水稻病毒，包括RRSV、RBSDV和RGSV。盡管RPA和LAMP都適合進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，但它們的靈敏度過(guò)高，容易受到污染，并且在現(xiàn)場(chǎng)環(huán)境中執(zhí)行單管多重檢測(cè)時(shí)面臨困難。

CRISPR/Cas 系統(tǒng)作為核酸檢測(cè)診斷的有效技術(shù)，巧妙地克服了與等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)相關(guān)的局限性，基于CRISPR-Cas13a和CRISPR-Cas12a開發(fā)的平臺(tái)已被證明可以在即時(shí)環(huán)境中快速、靈敏和特異性地檢測(cè)廣譜病原體，包括病毒RNA和DNA。然而，CRISPR-Cas檢測(cè)技術(shù)一直存在各種限制，例如原間隔區(qū)相鄰基序 (PAM) 或原間隔區(qū)側(cè)翼序列 (PFS) 的限制檢測(cè)序列以及與多重目標(biāo)檢測(cè)相關(guān)的問(wèn)題。

而與Cas核酸酶相比，某些pAgo蛋白具有序列特異性結(jié)合和切割靶DNA和RNA的能力。它們不受靶DNA中PAM序列存在的限制，因此在靶核酸選擇方面提供了更大的靈活性。與需要長(zhǎng)RNA向?qū)У腃as核酸酶相比，大多數(shù)pAgo蛋白使用短DNA分子作為向?qū)�。鑒于DNA合成相對(duì)于RNA的經(jīng)濟(jì)性和穩(wěn)定性優(yōu)勢(shì)，它促進(jìn)了基于Ago的核酸檢測(cè)系統(tǒng)的發(fā)展。與Cas9相比，由于它們的分子量較低，修飾和生產(chǎn)相對(duì)容易。

此外，它們還可以切割特定的底物序列，能夠檢測(cè)多個(gè)靶標(biāo)，這些靶標(biāo)已被轉(zhuǎn)化為各種新型核酸檢測(cè)例如Argonaute (TtAgo) 已被設(shè)計(jì)用于在PCR擴(kuò)增后富集稀有核酸。同樣，在病毒檢測(cè)領(lǐng)域，Pyrococcus furiosus Argonaute (PfAgo) 系統(tǒng)切割已被用于促進(jìn)對(duì)各種病毒的序列特異性檢測(cè)，如人瘤病毒、SARS-CoV-2和流感病毒。

近期中國(guó)計(jì)量大學(xué)孫凱團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種高度特異性和靈敏度的方法，結(jié)合 PfAgo 和等溫 RPA 擴(kuò)增(RT-RPA-PfAgo)，同時(shí)檢測(cè)多種病毒，該方法在特異性、靈敏度和重現(xiàn)性方面優(yōu)于RT-PCR，靈敏度范圍為 3.13 至 5.13 copies/μl。這項(xiàng)創(chuàng)新技術(shù)有望在各種植物病毒中具有潛在的適用性，從而能夠加快病毒核酸序列的鑒定。

RT-RPA-PfAgo 方法的原理
如Figure 1 所示，RT-RPA-PfAgo檢測(cè)的機(jī)制始于特定片段的 RT-RPA，然后在 5′-磷酸化 gDNA 的引導(dǎo)下，通過(guò) PfAgo蛋白特異性鑒定擴(kuò)增的片段。在gDNA和RPA擴(kuò)增子的一條鏈之間進(jìn)行堿基配對(duì)時(shí)，PfAgo觸發(fā)了靶DNA的10和11堿基之間的磷酸二酯鍵，這導(dǎo)致了新的5′-磷酸化ssDNA的形成，能夠作為隨后PfAgo切割的引導(dǎo)gDNA， 靶向合成設(shè)計(jì)的單鏈 DNA 探針，該探針在其末端用熒光團(tuán)和淬滅基團(tuán)標(biāo)記。FAM 和 BHQ1 由于探針末端序列的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，因?yàn)樗鼈兙哂谢パa(bǔ)性，因此保持在附近。探針的環(huán)序列被設(shè)計(jì)為與新生成的 5′-磷酸化ssDNA配對(duì)，從而通過(guò)PfAgo啟動(dòng)特異性探針切割，釋放熒光團(tuán)，隨后通過(guò)熒光法檢測(cè)熒光團(tuán)。由不同靶標(biāo)片段產(chǎn)生的獨(dú)特二級(jí)gDNA可指導(dǎo)PfAgo切割具有不同熒光標(biāo)記的特定探針，從而能夠在單個(gè)反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶標(biāo)。這種雙重識(shí)別和切割過(guò)程增強(qiáng)了該方法的特異性和準(zhǔn)確性，大大減少了潛在的假陽(yáng)性結(jié)果。
通過(guò)RT-RPA-PfAgo建立RRSV檢測(cè)工作流程
研究者基于凝膠電泳分析、熒光探針、視覺(jué)熒光等技術(shù)構(gòu)建了檢測(cè)工作流程。這些結(jié)果肯定了RT-RPA-PfAgo方法在檢測(cè)RRSV基因方面的有效性，并突出了其在病毒診斷領(lǐng)域的精確性和潛在適用性。 (A) gDNA的示意圖和為RRSV檢測(cè)量身定制的指定探針。PfAgo 切割區(qū)域和新形成的次級(jí) gDNA 以紅色突出顯示。三個(gè) 5’ 磷酸化的單鏈 DNA 向?qū)б宰仙�、綠色和黃色陰影描繪。分子信標(biāo)以藍(lán)色表示和強(qiáng)調(diào)。(B) PfAgo 介導(dǎo)的 RT-RPA 衍生擴(kuò)增子上的切割活性圖示，如在 3% TAE 凝膠上所示。(C) 藍(lán)光透射儀下陽(yáng)性樣品的視覺(jué)熒光。(D) 通過(guò)RT-RPA-PfAgo方法對(duì)RRSV的熒光檢測(cè)顯示為熒光曲線。NTC：無(wú)模板對(duì)照。

RT-RPA-PfAgo反應(yīng)的優(yōu)化
為了提高RT-RPA-PfAgo反應(yīng)的效率，關(guān)鍵組分的濃度，即Mn2+的濃度、gDNA 和 PfAgo 進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，Mn2+濃度為0.8 μM時(shí)， gDNA 濃度為 2 μM 濃度時(shí)、2 μM的PfAgo被確定為最有效的濃度。優(yōu)化條件下的峰值熒光值在 PfAgo 切割后 30 分鐘內(nèi)一致顯示，從而為所有后續(xù)反應(yīng)選擇 30 分鐘的持續(xù)時(shí)間。 (A–C) 圖說(shuō)明了熒光強(qiáng)度的時(shí)間積累，每個(gè)圖對(duì)應(yīng)于不同濃度的Mn2+gDNA 和 PfAgo。(D-F) 描述終點(diǎn)熒光信號(hào)的條形圖，具有不同濃度的 Mn2+、gDNA 和 PfAgo。包括誤差線，以指示三個(gè)重復(fù)中的標(biāo)準(zhǔn)誤差。RRSV RNA標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為104在這些實(shí)驗(yàn)中，每個(gè)反應(yīng)的copies數(shù)被用作模板。

使用RT-RPA-PfAgo系統(tǒng)同時(shí)檢測(cè)RRSV、RGSV和RBSDV
基于PfAgo特異性的引導(dǎo)定向切割能力，進(jìn)一步完善和增強(qiáng)了RT-RPA-PfAgo方法，實(shí)現(xiàn)了病毒RNA靶標(biāo)的多重檢測(cè)。靶向三個(gè)特定基因片段，通過(guò)設(shè)計(jì)多重RT-RPA引物、原代gDNA和相應(yīng)的探針實(shí)現(xiàn)了多重病毒核酸檢測(cè)。當(dāng)該方法在 50 分鐘內(nèi)檢測(cè)到 RRSV 的低濃度為 3.13 copies/μl、RGSV 的 4.13 copies/μl 和 RBSDV 的低濃度為 5.13 copies/μl時(shí) 。該方法在單次反應(yīng)中檢測(cè)到單靶標(biāo)、雙靶標(biāo)和三靶標(biāo)，在任何反應(yīng)組合中均未出現(xiàn)脫靶信號(hào)，并且多重反應(yīng)中的信號(hào)強(qiáng)度保持均勻。 (A) PfAgo 介導(dǎo)的 RT-RPA 擴(kuò)增子上的裂解，如在 3% TAE 凝膠上觀察到的那樣。(B-D) 分別使用連續(xù)稀釋的 RRSV、RGSV 和 RBSDV 進(jìn)行三重?zé)晒夥治龅臋z測(cè)限 (LoD) 測(cè)定。圖中的誤差線表示從三次重復(fù)計(jì)算出的標(biāo)準(zhǔn)偏差。(E) 描述RRSV、RGSV和RBSDV的RT-RPA-PfAgo熒光檢測(cè)的正交特異性的熱圖。(F) 使用RNA靶標(biāo)的混合物進(jìn)行三重?zé)晒夥治觥�熱圖的顏色強(qiáng)度對(duì)應(yīng)于在三次重復(fù)中觀察到的平均熒光強(qiáng)度。

通過(guò)RT-RPA-PfAgo進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)樣品分析
為了評(píng)估三重RT-RPA-PfAgo測(cè)定對(duì)田間樣品的療效，在不同地區(qū)收集了22份水稻葉組織樣本同步檢測(cè)。研究結(jié)果表明，RT-RPA-PfAgo 和 RT 方法之間完全一致 (100%) (Figure 5) 。這些結(jié)果提倡并強(qiáng)調(diào)了多重RT-RPA-PfAgo檢測(cè)準(zhǔn)確區(qū)分田間樣品中發(fā)現(xiàn)的各種病毒物種的能力，強(qiáng)調(diào)了其在植物病毒診斷中的潛在應(yīng)用。
前三行顯示RT-PCR檢測(cè)結(jié)果，而熱圖顯示了從RT-RPA-PfAgo方法獲得的熒光結(jié)果。S1–S22 表示每個(gè)字段樣本。陽(yáng)性對(duì)照表示為“PC”，無(wú)模板對(duì)照表示為“NTC”。