細(xì)胞計數(shù)儀的原理及選擇方法分享

自動細(xì)胞計數(shù)儀還有許多其他優(yōu)點，如易于操作的界面：可以評估細(xì)胞形狀與測量細(xì)胞大小，來確認(rèn)細(xì)胞類型特征。

2. 自動細(xì)胞計數(shù)方法
在本章節(jié)將會講述自動細(xì)胞計數(shù)的三種方法以及各自的優(yōu)缺點。

（1）電阻抗計數(shù)法
電阻抗是利用庫爾特原理對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。首先需要將細(xì)胞懸浮在弱電解質(zhì)溶液中，然后將該溶液通過直徑精確的小孔，通過施加小電壓，從而形成一個“感應(yīng)區(qū)”，當(dāng)每個細(xì)胞通過孔道時，都會置換出與自身體積相等的電解質(zhì)溶液，這種置換將產(chǎn)生電壓脈沖，該電壓脈沖代表細(xì)胞數(shù)量，可對其進(jìn)行監(jiān)測；較大的細(xì)胞會產(chǎn)生更大振幅的脈沖，因此脈沖高度與細(xì)胞大小成正比。所以樣品中細(xì)胞濃度是通過精確控制和測量通過孔的液體體積來確定的。
與光學(xué)計數(shù)相比，庫爾特計數(shù)法不受細(xì)胞顏色或折射率的影響，能夠計數(shù)樣品中存在的所有顆粒。如Beckman Coulter的Multisizer 4e細(xì)胞計數(shù)儀，能精確計數(shù)細(xì)胞的數(shù)量以及大小。電阻抗計數(shù)法的優(yōu)勢在于，與手工計數(shù)相比，該方法提升了計數(shù)的精確度與速度，但它不能進(jìn)行活細(xì)胞/死細(xì)胞的分析，無法得出細(xì)胞存活率，且不能精確計數(shù)成團(tuán)的細(xì)胞。

（2）基于圖像的細(xì)胞計數(shù)
細(xì)胞成像技術(shù)的進(jìn)步使得基于圖像的細(xì)胞計數(shù)儀迅速發(fā)展。這些系統(tǒng)使用與手動計數(shù)相同的原理，但通常操作更為簡便，并可以提供細(xì)胞形狀和大小的信息。操作流程是將樣本加入一次性計數(shù)板的腔室，調(diào)整預(yù)設(shè)的參數(shù)并進(jìn)行計數(shù)。
細(xì)胞計數(shù)是通過無標(biāo)記分析、細(xì)胞染色或熒光測量實現(xiàn)的，光學(xué)模式有明場、單色熒光或雙色熒光。這些自動細(xì)胞計數(shù)儀可以測量各種細(xì)胞類型和細(xì)胞密度，并且通常具有一系列附加功能，包括參數(shù)設(shè)置、細(xì)胞閥門大小、自動聚焦以及數(shù)據(jù)存儲和記錄。他們主要是對單視野進(jìn)行拍照計數(shù)，但近期研發(fā)的自動細(xì)胞計數(shù)儀可以拍攝多張視野圖像進(jìn)行計數(shù)，以提高細(xì)胞計數(shù)的精度。
基于圖像的細(xì)胞計數(shù)有眾多優(yōu)勢：

• 通量優(yōu)勢
• 易于操作的界面
• 運營成本低
• 大大減少計數(shù)錯誤
• 降低用戶之間的差異性

三、計數(shù)儀評價標(biāo)準(zhǔn)
市面上的細(xì)胞計數(shù)儀多種多樣，大家對各品牌的計數(shù)儀也褒貶不一，那么我們該如何客觀地評價一款細(xì)胞計數(shù)儀呢？這就需要參考細(xì)胞計數(shù)儀的計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。
儀器行業(yè)的發(fā)展推動了各種細(xì)胞計數(shù)儀的發(fā)展，并廣泛地應(yīng)用于總細(xì)胞計數(shù)和分類細(xì)胞計數(shù)。在缺乏參考資料的情況下，測量方法的準(zhǔn)確性很難確定。同時生物制劑的復(fù)雜性（如細(xì)胞類型、來源、制備等）也使這一問題更加突出。因此在沒有參照材料或參照方法的情況下，需要制定措施來保證細(xì)胞計數(shù)測量過程中的質(zhì)量。
本文提供了一種通過稀釋系列實驗設(shè)計和統(tǒng)計分析得出的一組質(zhì)量指標(biāo)來評估細(xì)胞計數(shù)的方法。該方法適用于總細(xì)胞計數(shù)、細(xì)胞分類計數(shù)、直接細(xì)胞計數(shù)和間接細(xì)胞計數(shù)，前提是測量過程符合實驗設(shè)計的標(biāo)準(zhǔn)（例如，將細(xì)胞應(yīng)為懸浮狀態(tài)），且該方法主要適用于真核細(xì)胞。
在細(xì)胞計數(shù)中獲得高置信度意味著測量既準(zhǔn)確又精確。具體來說，通過實驗設(shè)計和統(tǒng)計分析，可以評估描述偏離比例和變異系數(shù)（CV）的質(zhì)量指標(biāo)，以評估細(xì)胞計數(shù)測量過程的質(zhì)量。質(zhì)量指標(biāo)評估細(xì)胞計數(shù)測量過程的整體質(zhì)量，其中測量過程包括樣品制備和處理、數(shù)據(jù)采集以及數(shù)據(jù)處理/校正。

2. 稀釋分?jǐn)?shù)實驗設(shè)計
使用一個細(xì)胞懸液作為母液，在預(yù)期濃度范圍內(nèi)稀釋為不同濃度的可重復(fù)代表性測試樣本，如果濃度和組成完全相同，則可以使用額外的細(xì)胞原液。

注：該圖描述了從單一細(xì)胞懸液開始的實驗設(shè)計，其中通過獨立稀釋得到一組包含3個重復(fù)代表性樣本（n=3）的稀釋分?jǐn)?shù)，對每個代表性樣本進(jìn)行三次重復(fù)計數(shù)。
i表示細(xì)胞原液不同稀釋分?jǐn)?shù)的數(shù)量（i=1，.....，i）；df_i表示不同的稀釋分?jǐn)?shù)，值在0至1之間；n_i表示為目標(biāo)稀釋分?jǐn)?shù)的具有代表性的重復(fù)測試樣本數(shù)；k_ij表示第i個稀釋分?jǐn)?shù)的第j樣本的重復(fù)測量次數(shù)；Y_ijk表示來自細(xì)胞原液的第i個目標(biāo)稀釋分?jǐn)?shù)的第j個重復(fù)代表性樣本的第k個重復(fù)計數(shù)樣本的值。

④比例指數(shù)（PI）
用戶應(yīng)根據(jù)平滑殘差計算比例指數(shù)（PI）。
用戶應(yīng)根據(jù)細(xì)胞計數(shù)測量的預(yù)期用途選擇PI的計算方法。

3. 結(jié)果報告
細(xì)胞計數(shù)應(yīng)以細(xì)胞濃度表示，單位為細(xì)胞/ml，報告應(yīng)包含以下質(zhì)量指標(biāo)：

四、NanoEnTek細(xì)胞計數(shù)儀
目前，市面上有各種各樣的細(xì)胞計數(shù)儀，因為基于圖像的細(xì)胞計數(shù)原理與手動計數(shù)原理相同，所以大部分成像儀均是利用成像對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。目前被廣泛應(yīng)用的計數(shù)儀品牌如下表所示：

NanoEnTek 自動細(xì)胞計數(shù)儀系列曾在Select Science網(wǎng)站上獲得世界質(zhì)量認(rèn)證銀獎，該系列產(chǎn)品收獲了7200 多條評論和 4.8 分的星級評價(滿分5分)；并且一次性血細(xì)胞計數(shù)板系列也獲得了質(zhì)量認(rèn)證白金獎?wù)隆?/span>

蘇州奎克泰生物為韓國NanoEnTek中國區(qū)總授權(quán)�？�克泰生物憑借極佳的生命科學(xué)設(shè)備產(chǎn)品和優(yōu)質(zhì)的服務(wù)，斬獲“2024年度創(chuàng)新實驗室設(shè)備提供商”獎，充分體現(xiàn)了我司的生命科學(xué)（細(xì)胞）設(shè)備類產(chǎn)品質(zhì)量、技術(shù)服務(wù)和行業(yè)影響力等多方面的實力獲得了肯定。
我司代理的計數(shù)儀系列中，EVE™細(xì)胞計數(shù)儀簡單、快速、準(zhǔn)確，能對成團(tuán)細(xì)胞精準(zhǔn)計數(shù)、計算細(xì)胞活率，選擇細(xì)胞大小范圍；EVE™ Plus最快1秒出結(jié)果；EVE™ HT / HT FL高通量計數(shù)儀3min內(nèi)可一次性計48 個樣本。ADAM™ CellT是一款cGMP生產(chǎn)環(huán)境下可用的自動化細(xì)胞計數(shù)儀及ADAMII™ LS是一款基于熒光強度的桌面圖像型流式細(xì)胞分析儀，能夠提供多功能實驗和高準(zhǔn)確度結(jié)果（與流式細(xì)胞儀結(jié)果一致），穩(wěn)定性高。多款設(shè)備符合21 CFR Part 11要求，可在cGMP環(huán)境下使用，深受客戶贊譽。
 

穩(wěn)定性：分別使用EVE、手工計數(shù)板、競品對HepG2、MCF7、F9進(jìn)行計數(shù)，每個樣本重復(fù)7次，結(jié)果證明EVE自動細(xì)胞計數(shù)儀與競品相比，與手工計數(shù)結(jié)果更接近，且有更好的精確性。

準(zhǔn)確性：分別使用EVE PLUS與手工計數(shù)的方法對同一種細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)測試，結(jié)果證明EVE PLUS的計數(shù)結(jié)果與手工計數(shù)結(jié)果呈現(xiàn)高度相關(guān)性，且測量范圍優(yōu)于手工計數(shù)。

穩(wěn)定性：使用EVE Plus以及多臺儀器對多種細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，EVE Plus的計數(shù)結(jié)果與熒光計數(shù)儀的結(jié)果更接近，且穩(wěn)定性更好。
EVE™ HT高通量自動細(xì)胞計數(shù)儀 準(zhǔn)確性：與傳統(tǒng)血細(xì)胞計數(shù)儀做對比，EVE HT在不同濃度和存活率下，計數(shù)結(jié)果與人工計數(shù)高度一致。
穩(wěn)定性：通過5臺EVE HT進(jìn)行對比實驗，所得出的計數(shù)結(jié)果一致。
EVE™ HT FL高通量熒光自動細(xì)胞計數(shù)儀 準(zhǔn)確性：對于CHO細(xì)胞和PBMC，EVE™ HT FL測量的細(xì)胞總數(shù)與流式細(xì)胞儀所測結(jié)果高度相關(guān)。
穩(wěn)定性：通過5臺EVE™ HT FL儀器對三種細(xì)胞樣本（Jurkat、Hela、CHO）各測量16次，結(jié)果表明不同儀器之間測量結(jié)果高度一致。
2. ADAM系列

ADAM™ MC2&CellT超精確細(xì)胞計數(shù)儀
準(zhǔn)確性：ADAM MC2測量的細(xì)胞總數(shù)與流式細(xì)胞儀所測結(jié)果高度相關(guān)。
穩(wěn)定性：使用ADAM MC2在低、中、高細(xì)胞濃度條件下計數(shù)，不同細(xì)胞濃度下計數(shù)結(jié)果穩(wěn)定性高。
ADAM™ MC Plus & CellT Plus 超精確細(xì)胞計數(shù)儀
準(zhǔn)確性：對不同濃度的PBMC細(xì)胞樣本進(jìn)行計數(shù)比較，通過與流式細(xì)胞儀以及手工計數(shù)結(jié)果比較，計數(shù)結(jié)果高度相關(guān)。 穩(wěn)定性：ADAM MC PLUS/CellT PLUS在低、中、高細(xì)胞濃度條件下計數(shù)，不同細(xì)胞濃度下計數(shù)結(jié)果穩(wěn)定性高。 五、細(xì)胞計數(shù)儀選擇方法
我們面對各種品牌，如何為自己的實驗室選擇合適的細(xì)胞計數(shù)儀呢？雖然一些自動細(xì)胞計數(shù)儀（如流式細(xì)胞儀）的設(shè)備初始成本高，方案復(fù)雜，但是只要您的實驗室選擇合適的自動細(xì)胞計數(shù)儀將為以后的實驗帶來巨大的方便。在選擇儀器之前，我們需要確定影響計數(shù)方法選擇的重要因素：樣本類型。樣本類型決定了我們使用何種染色方法能更準(zhǔn)確地得到細(xì)胞的數(shù)量、細(xì)胞的存活率。

1. 樣本類型

• 實驗室的細(xì)胞類型一般多為常規(guī)傳代培養(yǎng)的細(xì)胞系，如腫瘤細(xì)胞系、哺乳動物細(xì)胞系等，這些細(xì)胞的直徑通常在5-40μm。這類型的細(xì)胞計數(shù)往往簡單易操作。
• 從組織或血液中分離的原代細(xì)胞，如PBMC、脾細(xì)胞等，但由于細(xì)胞碎片頻繁存在、細(xì)胞隨時間降解以及消化細(xì)胞懸液中的細(xì)胞群異質(zhì)性，準(zhǔn)確測定細(xì)胞數(shù)是富有挑戰(zhàn)的。
• 除細(xì)胞系與原代細(xì)胞外，也有一些別的樣本類型的計數(shù)需求，如酵母細(xì)胞、球藻細(xì)胞、芽孢桿菌等小粒徑樣本（1-10μm）。

我們需要根據(jù)細(xì)胞類型選擇合適的自動細(xì)胞計數(shù)儀：

• 針對于細(xì)胞系，我們可以選用基于臺盼藍(lán)的明場細(xì)胞計數(shù)儀。臺盼藍(lán)染色是最常用且成熟的對細(xì)胞計數(shù)且分析細(xì)胞活率的方法。TB是一種選擇性偶氮染料，無法進(jìn)入細(xì)胞膜完整的活細(xì)胞，僅對死細(xì)胞進(jìn)行染色。
• 針對于原代細(xì)胞、PBMC等，由于樣本的雜亂性，我們更推薦您選擇熒光細(xì)胞計數(shù)儀。使用熒光細(xì)胞計數(shù)儀能夠?qū)�混合�?xì)胞類型的復(fù)雜樣本進(jìn)行計數(shù)，且計數(shù)結(jié)果相較于使用臺盼藍(lán)計數(shù)原代細(xì)胞結(jié)果更加準(zhǔn)確。
• 針對于特殊樣本的計數(shù)需求，我們需要關(guān)注儀器的計數(shù)直徑范圍，確保我們選擇的計數(shù)儀能覆蓋自己實驗使用的樣本直徑。
• 自動細(xì)胞計數(shù)儀由于測量范圍的限制，所以也應(yīng)確保選擇的計數(shù)儀能覆蓋自己實驗使用的細(xì)胞濃度范圍。

計數(shù)儀基本的要求是計數(shù)的準(zhǔn)確性以及計數(shù)速度，所以下文詳細(xì)列出了各個產(chǎn)品的特性，有助于您選擇合適的計數(shù)儀設(shè)備。

2. 計數(shù)儀準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性
選擇自動細(xì)胞計數(shù)儀代替手工計數(shù)，計數(shù)儀結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性至關(guān)重要。
準(zhǔn)確性是計數(shù)儀計數(shù)結(jié)果與真實值之間的差異，可以與手工計數(shù)結(jié)果對比，或者借助標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行驗證計數(shù)儀準(zhǔn)確性。穩(wěn)定性是對同一樣本多次測量后的結(jié)果偏差在可允許范圍內(nèi)，可用CV值（變異系數(shù)）表示。一臺優(yōu)秀的計數(shù)儀，通常CV值＜5%。

3. 檢測效率
當(dāng)選擇適合自己實驗室的計數(shù)儀時，除了考慮樣本、準(zhǔn)確性與穩(wěn)定性之外，檢測效率也是十分值得關(guān)注的一個因素。手動計數(shù)的一個缺點是耗時耗力，那么自動計數(shù)儀逐漸替代手動計數(shù)的一大優(yōu)勢——省時省力，便是通過檢測效率來評估。一臺計數(shù)儀不僅要做到計數(shù)準(zhǔn)確與穩(wěn)定，快速也很重要。
檢測效率的評估主要通過單個樣本檢測時間與檢測通量評定。通常一個樣本，手動計數(shù)的時間約為3-5min，計數(shù)儀在10s-2min時間不等，并且檢測時間也會受到聚焦方式的影響。一塊血球計數(shù)板有兩個計數(shù)槽，現(xiàn)在市面上的大多數(shù)自動細(xì)胞計數(shù)儀也采用的兩通道計數(shù)板；也有一些高通量的細(xì)胞計數(shù)儀，適用于當(dāng)一天需要檢測的樣本數(shù)量巨大時。
下表匯總了我司現(xiàn)有計數(shù)儀的檢測效率，您可以根據(jù)自己的需求進(jìn)行選擇。


4. 21 CFR Part 11
在FDA 21 CFR Part 11 規(guī)定中，儀器設(shè)備的電子記錄被認(rèn)為具有與書面記錄和手寫簽名等同的效力，此法規(guī)確保了電子數(shù)據(jù)的有效性和可靠性。在生物制造行業(yè)，質(zhì)量控制和數(shù)據(jù)管理功能可以提供一個方便的方法來跟蹤多個細(xì)胞批次和監(jiān)測不同的細(xì)胞操作安全。所以計數(shù)儀是否符合 21 CFR Part 11的規(guī)定也作為計數(shù)儀選擇的一個補充參考。

5. 其他因素
除以上所列條目外，還有一些因素也值得考慮，如是否需要外接電腦、性價比、服務(wù)等方面。
①機(jī)型——我司自動細(xì)胞計數(shù)儀產(chǎn)品除高通量計數(shù)儀 HT與HT FL需要外接電腦外，其余設(shè)備均為一體機(jī)，自帶觸控屏，無需配備電腦便可進(jìn)行計數(shù)操作，且設(shè)備體積較小，無需占據(jù)實驗室內(nèi)部很大的空間，放置于桌面上便可通過觸控屏點擊操作，得到準(zhǔn)確的計數(shù)結(jié)果。
②細(xì)胞閥門——許多自動細(xì)胞計數(shù)儀能夠根據(jù)細(xì)胞的大小、形狀、亮度等參數(shù)調(diào)節(jié)，然后從計數(shù)范圍內(nèi)排除不需要的細(xì)胞。這一調(diào)節(jié)能夠為特定的下游應(yīng)用選擇細(xì)胞，從計數(shù)中去除樣品碎片，以及在有多種細(xì)胞類型的樣品中識別單個細(xì)胞類型。為了便于使用，許多自動細(xì)胞計數(shù)儀還具有“配置文件存儲”功能，允許用戶保存已自定義好的參數(shù)閾值，以便下一次直接使用該參數(shù)進(jìn)行計數(shù)，節(jié)省時間。
③成團(tuán)細(xì)胞計數(shù)——雖然應(yīng)該采取一切措施來確保樣品準(zhǔn)備得當(dāng)，但還是有細(xì)胞成團(tuán)/聚集的可能性，并且細(xì)胞成團(tuán)可能影響細(xì)胞的計數(shù)。自動細(xì)胞計數(shù)儀使用內(nèi)置的算法能提高對成團(tuán)細(xì)胞計數(shù)的準(zhǔn)確性。
④性價比——儀器本身的價格會受到計數(shù)原理、計數(shù)通量、預(yù)設(shè)調(diào)整等配置的影響，熒光計數(shù)的價格高于明場計數(shù)；計數(shù)通量越高那么價格也會越高；此外，還需考慮到耗材的成本以及后續(xù)儀器維護(hù)的成本，我司的計數(shù)儀耗材均使用一體壓成的工藝，更能保證計數(shù)的準(zhǔn)確性；使用流式以及庫爾特計數(shù)原理的計數(shù)儀都需進(jìn)行定期的維護(hù)，因此儀器后續(xù)的維護(hù)費用也是需要考慮的因素之一。
⑤服務(wù)——服務(wù)包括售前售后、儀器試用、技術(shù)支持以及質(zhì)保期。奎克泰生物會為您持續(xù)提供高效專業(yè)的服務(wù)。
了解以上的內(nèi)容后，相信無論是需要原代細(xì)胞計數(shù)還是細(xì)胞系計數(shù)、明場還是熒光、常規(guī)通量還是高通量，我司具有極高性價比與專業(yè)服務(wù)保障的產(chǎn)品，會有一款能滿足您的需求。