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ChIP-seq在揭示釀酒酵母Tho2介導Nrd1調控衰老相關基因表達中的應用

瀏覽次數:602 發(fā)布日期:2024-6-6  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負
衰老的特點是分子、細胞和器官損傷的逐漸積累,導致生物功能下降,對疾病和死亡的敏感性增加。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作為首個實現完整基因組測序的模式真核細胞,具有繁殖迅速、培養(yǎng)條件簡單、基因組小等優(yōu)點,并且與人類的衰老曲線相似,成為衰老壽命研究的理想模型;诮湍改P偷乃ダ涎芯拷沂玖硕喾N保守的壽命調控通路,并可以揭示衰老與mRNA出核之間的有趣關系。THO復合體是一個保守的多亞基組裝體,包括Hpr1、Tho2、Mft1、Thp2和Tex1,與其他因子(如TREX和TREX-2)錯綜復雜地連接,這些因子對mRNA出核至關重要。Nrd1與衰老之間的直接相關性尚未確定,但Nrd1、Rrp6和RNA監(jiān)測通路之間的復雜相互作用可能與細胞衰老過程密切相關?傊,衰老與RNA生物發(fā)生和出核之間的關系越來越引起人們的興趣,但其確切機制尚不清楚。

2024年5月20日,韓國漢陽大學Soo Young Cho/Hong-Yeoul Ryu/Seong Hoon Ahn合作研究發(fā)現,THO復合體的Hpr1和Tho2兩個組分缺失會導致復制壽命(replicative lifespan,RLS)減少,且與一種新的不依賴于Sir2的RLS調控通路相關。相關成果以“Tho2-mediated escort of Nrd1 regulates the expression of aging-related genes”為題發(fā)表在《Aging Cell》(IF 7.8 / 1區(qū))期刊上。

 

標題:Tho2-mediated escort of Nrd1 regulates the expression of aging-related genes(Tho2介導Nrd1調控衰老相關基因表達)
時間:2024-5-20
期刊:Aging Cell
影響因子:IF 7.8 / Q1
技術平臺:ChIP-seq、RNA-seq等

研究摘要:
THO復合體對于mRNA共轉錄成熟和出核至關重要。盡管核糖體組分Rrp6對hpr1Δ或tho2Δ突變體中的轉錄本螯合產生抗性,但這種螯合缺失未能減輕hpr1Δ中的RLS缺失。hpr1Δ或tho2Δ中的RLS缺失被與Rrp6互作的Nrd1特異性突變體的額外表達所抵消。這種作用依賴于Nrd1與RNA聚合酶II互作,Nrd1是衰老相關基因的轉錄調節(jié)因子,包括核糖體生物發(fā)生或RNA代謝基因。Nrd1過表達降低了Tho2依賴性通路中的RLS。而Tho2缺失通過誘導Nrd1在染色質上的任意結合來響應Nrd1過表達效應。全基因組ChIP-seq分析揭示在Tho2缺失后,Nrd1對與衰老相關的翻譯相關基因招募增加。本研究結果強調了Tho2介導的Nrd1通過衰老相關基因轉錄調控在壽命通路調控中的重要性。這項研究提供了對衰老分子機制的新見解,特別是關于RNA代謝和轉錄調控如何與衰老過程互作的理解,對Tho2-Nrd1軸的進一步研究可能有助于開發(fā)延緩衰老和改善健康壽命的策略。

實驗方法:
本研究使用釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae作為模型生物,通過基因敲除和過表達等方法,結合斑點實驗、RLS分析、CLS分析、ChIP-seq和RNA-seq等技術手段進行研究。

結果圖形:
(1)THO復合體以不依賴于Sir2方式調控RLS
圖1:THO復合體中的Hpr1和Tho2以Sir2非依賴性方式影響RLS。
(a、b)WT和指示突變體的RLS分析。平均壽命顯示在括號中。
 
(2)Hpr1不依賴于核酸外切酶成分Rrp6影響壽命
圖2:RRP6缺失可以挽救Rho誘導的細胞中受損的RLS,但不能挽救hpr1Δ細胞。
(a) 用空載體(pCM189)或表達Rho的質粒(pCM189-Ro)轉化的WT和rrp6∆菌株進行RLS分析,如圖1所示。為了進行生長分析,將所示菌株的十倍稀釋液點樣在Rho抑制(+Doxy)或Rho誘導(−Doxy)板上,然后在25°C下生長2-3天。
(b) 兩種不同遺傳背景(BY4741和W303α)中WT和指示突變菌株的RLS分析,如圖1所示。
(c) WT和指示突變體的CLS分析。括號中的兩個數字表示中位壽命和最長壽命,根據培養(yǎng)物分別達到50%和10%活性天數計算。
 
(3)Nrd1突變恢復rho誘導的RLS縮短
圖3:Nrd1突變體中Rho表達可以恢復縮短的復制性壽命(RLS)。
(a) Nrd1溫敏突變體nrd1-51(S16P)和nrd1-102(V379G)的示意圖。Nrd1結構域包括RNA聚合酶II CTD互作域(CID)、Nab3互作域(Nab3)、精氨酸-谷氨酰胺和精氨酸-絲氨酸富含區(qū)域(RE/RS)、RNA識別結構域(RRM)以及脯氨酸和谷氨酰胺富含區(qū)域(P/Q)。
(b) 在YPD培養(yǎng)基板上對nrd1-51和nrd1-102菌株在25、30和37°C下進行生長分析,如圖2a所述。
(c-e) 對野生型(WT)和指示突變體進行RLS分析,這些突變體被轉化空載體(c)、pCM189或pCM189-Rho(d, e),如圖1所述。
 
(4)Nrd1的不同截短變體能夠緩解tho2Δ細胞中的壽命缺陷。
圖4:Nrd1蛋白截短體過表達顯著恢復了tho2Δ細胞中受損的復制性壽命(RLS)。
(a) Nrd1點突變體和截短體示意圖。
(b、c、f) 如圖1所述,對野生型(WT)和指定突變體進行RLS分析。
(d) 如圖1所述,對WT或tho2Δ菌株轉化空載體(pAG425GPD)或表達指定Nrd1截短變體的質粒后進行RLS分析。
(e、h) 如圖1所述,對nrd1Δ或tho2Δ nrd1Δ菌株轉化表達NRD1或nrd1ΔCID的質粒后進行RLS分析。(g) 如圖2a所述,在25、30和37°C下對(f)中使用的菌株在YPD平板上進行生長分析。

(5)Nrd1通過Tho2依賴性通路調控壽命
圖5:Nrd1過表達以Tho2依賴性方式損害RLS。
 (a) PMA1、PYK1和ADH1基因示意圖。TATA/啟動子(Pro)和ORF分別由黑色和白色框表示。基因下方的條形圖顯示用于ChIP-qPCR分析的PCR產物的相對位置。
 (b) 在表達TAP標記的Nrd1菌株中使用IgG-瓊脂糖珠進行ChIP分析。BY4741(無標簽)菌株用作陰性對照。所指示基因的qPCR信號被定量并標準化到內部背景對照和input DNA。使用的引物對在(a)中指示。
 (c) 對WT和tho2Δ菌株轉化pAG425GPD或pAG425GPD-NRD1(NRD1-OE)進行RLS分析,如圖1所述。
(d) WT和tho2Δ菌株中Nrd1-TAP的ChIP-seq數據。餅圖顯示Nrd1峰在WT(左圖)和tho2Δ(右圖)菌株中的啟動子、外顯子、下游和遠端間隔區(qū)的分布。括號中的數字表示檢測到的位點數量。
(e)  在(d)中的Nrd1峰的維恩圖。
 (f) 對WT中Nrd1富集基因的GO富集分析點圖。
(g) 在(d)中的ChIP-seq數據的聚類熱圖。通過K-means聚類,將轉錄起始位點(TSS)和轉錄結束位點(TES)處顯著富集的Nrd1結合峰分為三個聚類。括號中的數字表示檢測到的Nrd1峰數量。
 (h) 在(g)中的ChIP reads密度分布。剖面圖顯示了每個聚類的平均ChIP信號。
 (i) 在(g)中基因的GO富集分析。條形圖表示每個聚類的GO生物過程的倍數富集。
 (j) 綜合基因組學瀏覽器(IGV)截圖顯示tho2Δ增加(紅色)或減少(藍色)Nrd1招募的水平。從WT中的IP/INPUT峰值比率中減去tho2Δ中的峰值比率,以說明在指定基因中觀察到的變化。

(6)與翻譯和核轉運相關的基因在tho2Δ和衰老細胞中均下調

圖6:在酵母細胞中,Tho2蛋白缺失與衰老細胞之間mRNA表達譜比較。
(a) 火山圖顯示tho2Δ菌株與野生型(WT)相比差異表達的基因。
(b) 對先前的RNA-seq實驗(Hendrickson等人,2018年)中的衰老細胞基因進行GO富集分析,并在(a)中展示。通過過濾數據(p值≤0.05和|倍數變化|>1),獲取了衰老細胞與年輕細胞相比差異表達的基因列表。條形圖表示在上調(紅色)或下調(藍色)基因中前11個GO生物過程術語的富集倍數。
(c) Nrd1 ChIP讀取密度分布,顯示了與WT相比,tho2Δ菌株中差異表達的基因。對于上調和下調基因的分析(分別是上圖和下圖),通過過濾數據(p值≤0.05和|倍數變化|>2),分別獲取了145個和182個基因。
(d) 對(c)中上調(紅色)或下調(藍色)基因的GO分析,如(a)中所述。
(e) IGV(綜合基因組學瀏覽器)截圖,顯示了tho2Δ改變了Nrd1的招募水平,如圖5J所述。
(f–h) 對衰老細胞(Hendrickson等人,2018年)中差異表達基因的Nrd1結合峰進行聚類分析,這些基因在WT和tho2Δ菌株中的Nrd1占據情況。熱圖(f)、密度剖面圖(g)和GO分析(h)是K-means聚類比對 reads位置結果。
(i) Tho2在調控復制性壽命(RLS)中作用的示意圖。tho2缺失未能防止Nrd1的過度招募,導致與翻譯相關的基因表達下降,進而導致RLS減少。
 
(7)參與翻譯和RNA加工的基因亞群是Tho2和Nrd1的靶標

圖7:衰老細胞中Nrd1結合基因與差異表達基因的比較分析。
(a) 在衰老細胞中,Nrd1結合基因與上調(紅色)或下調(藍色)基因重疊的GO分析,如圖6b所示。條形圖顯示了在ORF或3′UTR中結合位點的Nrd1結合基因的前七個GO生物過程的倍數富集。如果Nrd1在這些區(qū)域有結合位點,那么這些基因在衰老細胞中的表達變化可能與Nrd1結合有關。
(b) (a)中顯示的Nrd1結合基因的維恩圖。中間的表格顯示了Nrd1在ORF和3′-UTR或僅在3′-UTR結合的代表性基因,以及它們與相鄰基因的長度和距離。


圖8:tho2Δ細胞中Nrd1結合基因與差異表達基因的比較。
(a) Nrd1結合基因表達由tho2Δ上調(紅色)或下調(藍色)的前八到九個GO分析,如圖7a所示。這些基因在tho2Δ細胞中的表達水平與野生型細胞相比有顯著變化,并且這些變化的基因與Nrd1的結合位點有關。
(b) (a)中顯示的Nrd1結合基因的Venn圖分析,如圖7b所示。確定哪些基因僅在tho2Δ細胞中上調或下調,哪些基因同時在tho2Δ和其他條件下也有差異表達,以及哪些基因不受tho2Δ影響。

參考文獻:
Liu Y, Park JM, Lim S, Duan R, Lee DY, Choi D, Choi DK, Rhie BH, Cho SY, Ryu HY, Ahn SH. Tho2-mediated escort of Nrd1 regulates the expression of aging-related genes. Aging Cell. 2024 May 20:e14203. doi: 10.1111/acel.14203. PubMed PMID: 38769776.
來源:深圳市易基因科技有限公司
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標簽: DNA甲基化
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