實時熒光定量PCR(RT-qPCR)反應體系的靈敏度提高方法
實時熒光定量 PCR (RT-qPCR) 是一種用于實時擴增和檢測特定 DNA 或 RNA 序列的分子生物學技術。該方法利用熒光染料或探針，當與擴增的 DNA 或 RNA 分子結合時會發(fā)出信號，從而可以對目標序列進行量化。熒光定量PCR其本質是通過熒光探針或熒光DNA結合染料和實時熒光定量PCR儀器對PCR擴增產(chǎn)物進行檢測和定量，儀器在PCR熱循環(huán)的過程中測量熒光。
RT-PCR反應體系的靈敏度提高方法：
1、分離高質量RNA
成功的cDNA合成來自高質量的RNA。高質量的RNA應保證全長并且不含逆轉錄酶的抑制劑如EDTA或SDS等，以及盡可能減少基因組DNA污染。RNA的質量決定了你能夠轉錄到cDNA上的序列信息量的大值。
2、促進逆轉錄的添加劑
包括甘油和DMSO在內的添加劑加到*鏈合成反應中，可以減低核酸雙鏈的穩(wěn)定并解開RNA二級結構，多可以加入20％的甘油或10％的DMSO而不影響SuperScriptⅡ或M-MLV的活性。AMV也可以耐受多20％的甘油而不降低活性。
3、提高逆轉錄保溫溫度
較高的保溫溫度有助于RNA二級結構的打開，增加了反應的產(chǎn)量。對于多數(shù)RNA模板，在沒有緩沖液或鹽的條件下，將RNA和引物在65℃保溫，然后迅速置于冰上冷卻，可以消除大多數(shù)二級結構，從而使引物可以結合。
4、使用無RNaseH活性的逆轉錄酶
在逆轉錄反應中經(jīng)常加入RNase抑制劑以增加cDNA合成的長度和產(chǎn)量。不管是M-MLV還是AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有內源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互競爭RNA模板與DNA引物或cDNA延伸鏈間形成的雜合鏈，并降解RNA：DNA復合物中的RNA鏈。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作為合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的產(chǎn)量和長度。因此消除或大大降低逆轉錄酶的RNaseH活性將會大有裨益。
5、RNaseH處理
在PCR之前使用RNaseH處理cDNA合成反應可以提高靈敏度。對于某些模板，在cDNA合成反應中的RNA會阻止擴增產(chǎn)物的結合，在這種情況下，RNaseH處理可以增加靈敏度。一般當擴增較長的全長cDNA目標模板時，RNaseH處理是必需的，比如低拷貝的tuberous scherosisⅡ。對這種困難模板，RNaseH的處理加強了SuperScriptⅡ或AMV合成的cDNA所產(chǎn)生的信號。對于多數(shù)RT-PCR反應，RNaseH處理是可選的，因為95℃保溫的PCR變性步驟一般會將RNA：DNA復合物中的RNA水解掉。
6、小量RNA檢測方法的提高
當僅有小量RNA時，RT-PCR尤其具有挑戰(zhàn)性。在RNA分離過程中加入的作為載體的糖元有助于增加小量樣品的產(chǎn)量�？梢栽诩尤隩rizol的同時加入無RNase的糖元。對于小于50mg的組織106個培養(yǎng)細胞的樣品，無RNase糖元的建議濃度為250μg/ml。在使用SuperScriptⅡ的逆轉錄反應中加入乙�；疊SA可以增加靈敏度，而且對于小量RNA，減少SuperScriptⅡ的量并加40單位的RnaseOut核酸酶抑制劑可以提高檢測的水平。如果在RNA分離過程中使用了糖元，仍然建議在使用SuperScriptⅡ進行逆轉錄反應時加入BSA或RNase抑制劑。
7、減少基因組DNA污染
RT-PCR所遇到的一個潛在的困難是RNA中有基因組DNA污染，可以在逆轉錄之前使用擴增級的DNaseⅠ對RNA進行處理以除去沾染的DNA。將樣品在2.0mM EDTA中65℃保溫10分鐘以終止DNaseⅠ消化。EDTA可以螯合鎂離子，防止高溫時所發(fā)生的依賴于鎂離子的DNA水解。為了將擴增的cDNA同沾染的基因組DNA擴增產(chǎn)物分開，可以設計分別同分開的外顯子退火的引物。來源于cDNA的PCR產(chǎn)物會比來源于污染的基因組DNA的產(chǎn)物短。另外對每個RNA模板進行一個無逆轉錄的對照實驗，以確定一個給定片段是來自基因組DNA還是cDNA。在無逆轉錄時所得到的PCR產(chǎn)物來源于基因組。
RT-PCR反應體系的靈敏度提高方法：
1、分離高質量RNA
成功的cDNA合成來自高質量的RNA。高質量的RNA應保證全長并且不含逆轉錄酶的抑制劑如EDTA或SDS等，以及盡可能減少基因組DNA污染。RNA的質量決定了你能夠轉錄到cDNA上的序列信息量的大值。
2、促進逆轉錄的添加劑
包括甘油和DMSO在內的添加劑加到*鏈合成反應中，可以減低核酸雙鏈的穩(wěn)定并解開RNA二級結構，多可以加入20％的甘油或10％的DMSO而不影響SuperScriptⅡ或M-MLV的活性。AMV也可以耐受多20％的甘油而不降低活性。
3、提高逆轉錄保溫溫度
較高的保溫溫度有助于RNA二級結構的打開，增加了反應的產(chǎn)量。對于多數(shù)RNA模板，在沒有緩沖液或鹽的條件下，將RNA和引物在65℃保溫，然后迅速置于冰上冷卻，可以消除大多數(shù)二級結構，從而使引物可以結合。
4、使用無RNaseH活性的逆轉錄酶
在逆轉錄反應中經(jīng)常加入RNase抑制劑以增加cDNA合成的長度和產(chǎn)量。不管是M-MLV還是AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有內源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互競爭RNA模板與DNA引物或cDNA延伸鏈間形成的雜合鏈，并降解RNA：DNA復合物中的RNA鏈。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作為合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的產(chǎn)量和長度。因此消除或大大降低逆轉錄酶的RNaseH活性將會大有裨益。
5、RNaseH處理
在PCR之前使用RNaseH處理cDNA合成反應可以提高靈敏度。對于某些模板，在cDNA合成反應中的RNA會阻止擴增產(chǎn)物的結合，在這種情況下，RNaseH處理可以增加靈敏度。一般當擴增較長的全長cDNA目標模板時，RNaseH處理是必需的，比如低拷貝的tuberous scherosisⅡ。對這種困難模板，RNaseH的處理加強了SuperScriptⅡ或AMV合成的cDNA所產(chǎn)生的信號。對于多數(shù)RT-PCR反應，RNaseH處理是可選的，因為95℃保溫的PCR變性步驟一般會將RNA：DNA復合物中的RNA水解掉。
6、小量RNA檢測方法的提高
當僅有小量RNA時，RT-PCR尤其具有挑戰(zhàn)性。在RNA分離過程中加入的作為載體的糖元有助于增加小量樣品的產(chǎn)量�？梢栽诩尤隩rizol的同時加入無RNase的糖元。對于小于50mg的組織106個培養(yǎng)細胞的樣品，無RNase糖元的建議濃度為250μg/ml。在使用SuperScriptⅡ的逆轉錄反應中加入乙�；疊SA可以增加靈敏度，而且對于小量RNA，減少SuperScriptⅡ的量并加40單位的RnaseOut核酸酶抑制劑可以提高檢測的水平。如果在RNA分離過程中使用了糖元，仍然建議在使用SuperScriptⅡ進行逆轉錄反應時加入BSA或RNase抑制劑。
7、減少基因組DNA污染
RT-PCR所遇到的一個潛在的困難是RNA中有基因組DNA污染，可以在逆轉錄之前使用擴增級的DNaseⅠ對RNA進行處理以除去沾染的DNA。將樣品在2.0mM EDTA中65℃保溫10分鐘以終止DNaseⅠ消化。EDTA可以螯合鎂離子，防止高溫時所發(fā)生的依賴于鎂離子的DNA水解。為了將擴增的cDNA同沾染的基因組DNA擴增產(chǎn)物分開，可以設計分別同分開的外顯子退火的引物。來源于cDNA的PCR產(chǎn)物會比來源于污染的基因組DNA的產(chǎn)物短。另外對每個RNA模板進行一個無逆轉錄的對照實驗，以確定一個給定片段是來自基因組DNA還是cDNA。在無逆轉錄時所得到的PCR產(chǎn)物來源于基因組。
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