Azure多功能分子成像系統(tǒng)助力揭示一種新型抗生素磷脂糖轉(zhuǎn)運抑制機制
革蘭氏陰性菌中富含脂多糖（LPS）的外膜結(jié)構(gòu)對維持細胞活力至關(guān)重要，破壞外膜會增加其抗生素敏感性。外膜組裝過程中，LPS需穿過周質(zhì)空間從內(nèi)膜運輸至細胞表面。此過程依賴于內(nèi)膜上的脂多糖轉(zhuǎn)運蛋白LptB2FGC，通過水解ATP，將LPS傳遞給由LptF、LptC、可溶性周質(zhì)蛋白LptA及整合膜蛋白LptD的周質(zhì)部分形成的蛋白質(zhì)橋進行運輸。最近發(fā)現(xiàn)的大環(huán)肽家族被認為可抑制脂多糖轉(zhuǎn)運，且生化實驗顯示出對不動桿菌的抗性，但仍缺少結(jié)構(gòu)信息以確定這些抗生素抑制LPS轉(zhuǎn)運的分子機制。
近日，哈佛大學在Nature雜志發(fā)表了題為“A new antibiotic traps lipopolysaccharide in its intermembrane transporter”的文章，解析了LptB2FGC復(fù)合物結(jié)合大環(huán)肽的結(jié)構(gòu)，明確了LPS的轉(zhuǎn)運抑制機制，從而為下一代抗生素的開發(fā)和應(yīng)用繪制了藍圖。
1 藥物與LPS的結(jié)合及結(jié)構(gòu)
冷凍電鏡下，大環(huán)肽化合物1與LptB2FG和結(jié)合的LPS分子形成廣泛的接觸（圖1c）。作者解析了大腸桿菌異源表達及A. baylyi 菌株表達的LptB2FGC復(fù)合物在LPS存在下結(jié)合大環(huán)肽化合物1的結(jié)構(gòu)（圖1d），呈現(xiàn)出高度一致性。
圖1c、不動桿菌LptB2FG復(fù)合物與LPS、化合物1結(jié)合的內(nèi)膜冷凍電鏡結(jié)構(gòu)d，轉(zhuǎn)運體腔中不動桿菌LptB2FG與不動桿菌LPS、化合物1結(jié)合的冷凍電鏡圖（白色），與大腸桿菌LPS和1結(jié)合不動桿菌LptB2FG的結(jié)構(gòu)疊加。
大環(huán)肽化合物的結(jié)合袋由LptF (Glu58, Glu249, Trp271, Val314, Ile317, Arg320和Thr321)及LptG (Leu36)組成(圖2)。這些關(guān)鍵殘基的突變會不同程度地降低菌株的抗生素敏感性。同時，作者基于SDS-PAGE及Western Blot（Azure多功能分子成像系統(tǒng)成像），監(jiān)測LPS從LptB2FGC復(fù)合物釋放向LPtA的轉(zhuǎn)運。結(jié)果顯示，化合物1可抑制野生型LptB2FGC復(fù)合物釋放LPS（圖2c），但無法抑制兩種突變體復(fù)合物（E249K及I317N）釋放LPS（圖2d）。證實了大環(huán)肽-LptFG接觸對抑制不動桿菌菌株生長的重要性。
圖2. 轉(zhuǎn)運體中化合物1與LPS結(jié)合的中間態(tài)。a，LptF與LPS及化合物1的三元復(fù)合體結(jié)構(gòu)圖， c,d, 化合物1可抑制野生型LptB2FGC向LptA轉(zhuǎn)運LPS(c)，但對LptB2FE249KGC或LptB2FI317NGC 無效(d)（Azure多功能分子成像系統(tǒng)拍攝）。e，轉(zhuǎn)運體腔中LptB2FG結(jié)合LPS（白色）與LptB2FG-LPS-1結(jié)構(gòu)的疊加圖。
2 藥物捕獲LPS及影響因素
作者另外使用冷凍電鏡解析了LptB2FG-LPS的結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示其整體構(gòu)象和接觸幾乎與LptB2FG-LPS-1（化合物1存在）時相同(圖2e)。表明該狀態(tài)可作為抗生素開發(fā)的藥物作用構(gòu)象。此外，LptF Arg30和Arg55對不動桿菌中復(fù)合物的功能至關(guān)重要，可能有助于在運輸過程中定位LPS。
作者隨后構(gòu)建了LPS的LpxM缺失突變體，探究不動桿菌LPS的結(jié)構(gòu)改變對化合物1抑制效力的影響。Western Blot實驗顯示（Azure多功能分子成像系統(tǒng)成像），當化合物1濃度達到抑制野生型LPS運輸所需濃度的20倍時，從大腸桿菌ΔlpxM分離的LPS的運輸是可能的(圖3b)。不動桿菌ΔLpxM LPS對化合物1的易感性比野生型低30倍 ，與此結(jié)果一致。由于ΔLpxM菌株毒力較低，因此lpxM缺失可能不會導(dǎo)致體內(nèi)大環(huán)肽的易感性降低。
圖3. 化合物1對野生型及ΔLpxM菌株的LPS轉(zhuǎn)運抑制情況。ΔLpxM菌株中分離的LPS使LptB2FGC對1具有抗性。
3 LptC螺旋與藥物的結(jié)合競爭
LptC螺旋是協(xié)調(diào)LPS運輸與ATP水解的重要因素。LptB2FG-LPS-1結(jié)構(gòu)顯示，LPS轉(zhuǎn)運過程中，化合物1與LptC TM螺旋具有結(jié)合競爭。這解釋了化合物3的殺菌效力相當，但其抑制LptB2FGC復(fù)合物釋放LPS的有效性大不如1和2的原因。
冷凍電鏡顯示，化合物1和2含有相對較大的取代基，可比化合物3更有效地與LptC TM螺旋競爭。由此推斷，LptC TM螺旋缺失時，化合物1、2、3均應(yīng)抑制LPS的釋放。作者隨后在體外構(gòu)建轉(zhuǎn)運實驗，通過Western Blot實驗（Azure多功能分子成像系統(tǒng)成像）進行驗證。與預(yù)測一致，化合物3在體外不抑制LptB2FGC向LptA的轉(zhuǎn)運，但1-3在抑制LptB2FG-ΔTM-C對LPS的轉(zhuǎn)運方面具有同等效力(圖4d)。
圖4d, 化合物3在體外不抑制LptB2FGC向LptA的轉(zhuǎn)運，但1、2和3在體外抑制LptB2FG-ΔTM-C對LPS的轉(zhuǎn)運。e, 化合物 1以LPS依賴的方式增加LptB2FG、LptB2FGC和LptB2FG-ΔTM-C的ATP酶活性。f, SPA測量顯示化合物2在LPS存在而LptC不存在的情況下與Lpt結(jié)合。
4 藥物將ATP酶活性與LPS轉(zhuǎn)運分離
LptB2FG轉(zhuǎn)運體中的LPS裝載可刺激ATP酶活性。由于大環(huán)肽在轉(zhuǎn)運體中捕獲LPS，因此將化合物1-3添加到LptB2FG和LptB2FGΔTM-LptC復(fù)合物中時，均導(dǎo)致ATP酶活大幅增加(圖4e) �？梢�，化合物與LptB2FG的結(jié)合是大環(huán)肽發(fā)揮活性的關(guān)鍵。臨近閃爍分析(SPA)驗證了上述結(jié)論，且再次驗證了1-3均有相當?shù)臍⒕Я�，以及大環(huán)肽靶與LptC TM螺旋競爭結(jié)合的作用機制。
5 總結(jié)與討論
總的來說，本研究揭示了大環(huán)肽家族的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運抑制機制，揭示了Lpt轉(zhuǎn)運體的可藥物構(gòu)象，并為這類抗生素擴展到其他革蘭氏陰性病原體的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。
原文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41586-023-06799-7
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1 藥物與LPS的結(jié)合及結(jié)構(gòu)
冷凍電鏡下，大環(huán)肽化合物1與LptB2FG和結(jié)合的LPS分子形成廣泛的接觸（圖1c）。作者解析了大腸桿菌異源表達及A. baylyi 菌株表達的LptB2FGC復(fù)合物在LPS存在下結(jié)合大環(huán)肽化合物1的結(jié)構(gòu)（圖1d），呈現(xiàn)出高度一致性。
大環(huán)肽化合物的結(jié)合袋由LptF (Glu58, Glu249, Trp271, Val314, Ile317, Arg320和Thr321)及LptG (Leu36)組成(圖2)。這些關(guān)鍵殘基的突變會不同程度地降低菌株的抗生素敏感性。同時，作者基于SDS-PAGE及Western Blot（Azure多功能分子成像系統(tǒng)成像），監(jiān)測LPS從LptB2FGC復(fù)合物釋放向LPtA的轉(zhuǎn)運。結(jié)果顯示，化合物1可抑制野生型LptB2FGC復(fù)合物釋放LPS（圖2c），但無法抑制兩種突變體復(fù)合物（E249K及I317N）釋放LPS（圖2d）。證實了大環(huán)肽-LptFG接觸對抑制不動桿菌菌株生長的重要性。
2 藥物捕獲LPS及影響因素
作者另外使用冷凍電鏡解析了LptB2FG-LPS的結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示其整體構(gòu)象和接觸幾乎與LptB2FG-LPS-1（化合物1存在）時相同(圖2e)。表明該狀態(tài)可作為抗生素開發(fā)的藥物作用構(gòu)象。此外，LptF Arg30和Arg55對不動桿菌中復(fù)合物的功能至關(guān)重要，可能有助于在運輸過程中定位LPS。
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3 LptC螺旋與藥物的結(jié)合競爭
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總的來說，本研究揭示了大環(huán)肽家族的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運抑制機制，揭示了Lpt轉(zhuǎn)運體的可藥物構(gòu)象，并為這類抗生素擴展到其他革蘭氏陰性病原體的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。
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