質(zhì)量光度法（MassPhotometry）在冷凍電鏡分析前評(píng)估樣品質(zhì)量的應(yīng)用

Fig1. 質(zhì)量光度法大大提高了在冷凍電子顯微鏡前表征樣品的效率
 

使用電子顯微鏡的時(shí)間永遠(yuǎn)不夠用。為了充分利用時(shí)間，您需要簡化冷凍電鏡工作流程。陰性染色電鏡（NS-EM）可以幫助您優(yōu)化緩沖液條件，并在進(jìn)入冷凍電鏡之前評(píng)估樣品質(zhì)量，但這是一項(xiàng)耗時(shí)、昂貴的技術(shù)。您需要的是一種能加快分析速度的經(jīng)濟(jì)有效的方法。來自英國牛津Refeyn公司的TwoMP分析系統(tǒng) 是一種使用質(zhì)量光度法表征生物分子的分析工具，它可以幫助您優(yōu)化樣品分析，而無需花費(fèi)高額成本用于樣品評(píng)估。在本篇介紹中，Refeyn公司的產(chǎn)品經(jīng)理 Cathryn Langley 博士將為我們?cè)敿?xì)介紹這款產(chǎn)品。

Cathryn："在過去幾年中，質(zhì)量光度法開始進(jìn)入越來越多的結(jié)構(gòu)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。這是因?yàn)槿藗冋J(rèn)識(shí)到，在冷凍電鏡分析之前，利用質(zhì)量光度法作為一種快速、實(shí)驗(yàn)簡單的篩選樣品質(zhì)量的方法，可以節(jié)省時(shí)間和成本。該技術(shù)只需少量樣品，就能測(cè)量原生狀態(tài)下的生物大分子，其在寬動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)的單分子分辨率使其非常適合評(píng)估樣品的單分散性。下面，我將回答我們最常遇到的關(guān)于使用 TwoMP 的優(yōu)勢(shì)、樣本要求和儀器本身的問題，并為您提供一些有用的資源。"

1.TwoMP 如何幫助優(yōu)化冷凍電鏡樣品？

TwoMP 質(zhì)量光度計(jì)可以幫助您快速確定樣品純度，并在進(jìn)行冷凍電鏡分析之前測(cè)量形成所需復(fù)合物的樣品群的百分比。收集這些數(shù)據(jù)是樣品質(zhì)量控制的重要步驟，可幫助您提高結(jié)構(gòu)分辨率和數(shù)據(jù)重現(xiàn)性。您還可以使用 TwoMP 來優(yōu)化緩沖液條件，以促進(jìn)復(fù)合物的形成，最近的總結(jié)見后附參考文獻(xiàn) [1] 和 [2]。該儀器與去垢劑兼容，因此您可以在分析過程中將膜蛋白和脂質(zhì)納米盤以及水溶性的生物大分子保持在溶液中。這樣，您就可以保持蛋白質(zhì)的原生狀態(tài)或盡可能接近原生狀態(tài)。

2.質(zhì)量光度法與其他生物分子表征技術(shù)相比有何優(yōu)勢(shì)？

如后附參考文獻(xiàn) [2]-[4] 所述，來自 TwoMP 的數(shù)據(jù)與來自負(fù)染電鏡（NS-EM）、電荷檢測(cè)質(zhì)譜（CD-MS）和原生質(zhì)譜（Native Mass）的數(shù)據(jù)非常吻合。與這些技術(shù)相比，質(zhì)量光度法的優(yōu)勢(shì)在于速度更快、操作更簡單。與動(dòng)態(tài)光散射（DLS）或多角度光散射（MALS）等光散射技術(shù)相比，質(zhì)量光度法是一種單分子/顆粒 檢測(cè)技術(shù)。這意味著它可以計(jì)算樣品中有多少顆粒具有特定的質(zhì)量。質(zhì)量光度法具有動(dòng)態(tài)范圍廣、可測(cè)質(zhì)量范圍大的特點(diǎn)，這使得它在檢測(cè)低豐度物種（如聚集體）時(shí)更加靈敏，并能檢測(cè)樣品中的亞群。

3.您說它比陰性染色EM更快，那么 TwoMP 的測(cè)量需要多長時(shí)間？

使用 TwoMP 進(jìn)行每次測(cè)量只需一分鐘！一位來自歐洲結(jié)構(gòu)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的 TwoMP 用戶告訴我們："通常情況下，我可以在一分鐘內(nèi)通過質(zhì)量光度法檢查樣品，而我的陰性染色可能需要幾個(gè)小時(shí)。在實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化階段，TwoMP 確實(shí)可以為您節(jié)省幾個(gè)小時(shí)的時(shí)間"[5]。

4.與陰性染色 EM 相比，使用 TwoMP 的成本有多高？

我們都知道冷凍電鏡和陰性染色電鏡是昂貴的技術(shù)。在電子顯微鏡中心（如威斯康星大學(xué)的電子顯微鏡中心）制備和運(yùn)行陰性染色樣品網(wǎng)格的成本每小時(shí)可輕松超過 100 美元。相比之下，根據(jù)我們的計(jì)算，每次質(zhì)量光度測(cè)量所需的消耗品成本不到 5 美元。由于儀器非常容易使用，因此不需要訓(xùn)練有素的操作人員，這也有助于節(jié)省管理費(fèi)用�？傊�，TwoMP 無疑是一款經(jīng)濟(jì)高效的分析工具。

Fig2 .質(zhì)量光度測(cè)量可大大節(jié)省樣品、用戶和儀器時(shí)間、實(shí)驗(yàn)室空間和電力。 
 

關(guān)于 TwoMP 儀器

1.TwoMP 需要像電子顯微鏡那樣的特殊操作環(huán)境嗎？

TwoMP 是一種低占地面積的儀器，可以放置在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。與電子顯微鏡不同，它不需要自己的專用房間。TwoMP 自帶防震裝置，整個(gè)裝置可整齊地安裝在現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)室中，無需額外的建筑。

2.TwoMP 的質(zhì)量范圍有多大？

TwoMP 可以穩(wěn)定測(cè)量 30 kDa 到 5 MDa 的分子質(zhì)量，包括了在此質(zhì)量范圍內(nèi)的各種蛋白、核酸、抗體、質(zhì)粒、蛋白聚集體、核酸蛋白復(fù)合體及人工合成納米顆粒等。

關(guān)于樣品

1.質(zhì)量光度法是否需要使用重金屬染色或標(biāo)記樣品？

質(zhì)量光度法是一種無標(biāo)記技術(shù)，可測(cè)量原生狀態(tài)下生物大分子的質(zhì)量，因此您可以使用任何適合您的冷凍電鏡樣品的緩沖液條件。不需要陰性染色 EM 中使用的有害重金屬，也不需要將樣品烘干，因?yàn)楹娓蓵?huì)在數(shù)據(jù)中引入偽影，并增加日后優(yōu)化冷凍電鏡緩沖條件的難度。

2.質(zhì)量光度測(cè)量需要多少樣品？

質(zhì)量光度測(cè)量只需要很少的樣品，大約 10-20 µL。最佳樣品濃度通常在10納摩爾以下。質(zhì)量光度測(cè)量實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，您將有大量剩余樣品用于冷凍電子顯微鏡實(shí)驗(yàn)。

延伸閱讀

Read more about the Two^MP mass photometer.（Refeyn | TwoMP）

在這份產(chǎn)品數(shù)據(jù)表中，我們?cè)敿?xì)介紹了 TwoMP 的規(guī)格和功能，以及隨附的易于使用的軟件。

Featured publications | Refeyn Website

匯集全球范圍內(nèi)運(yùn)用了質(zhì)量光度法的新近發(fā)表文獻(xiàn)，動(dòng)態(tài)更新

（外網(wǎng)可見）Webinar: Measuring the heterogeneity of macromolecular machines by mass photometry

在本次網(wǎng)絡(luò)研討會(huì)上，我們將展示質(zhì)量光度測(cè)量法通過測(cè)量單個(gè)分子的質(zhì)量，可提供有關(guān)樣品異質(zhì)性的重要數(shù)據(jù)，其測(cè)量結(jié)果可與用于評(píng)估樣品純度的其他工具（如 SDS-PAGE、SEC、DLS 和陰性染色 EM）的測(cè)量結(jié)果相媲美。

References

[1] S. Niebling et al., “Biophysical Screening Pipeline for Cryo-EM Grid Preparation of Membrane Proteins,” Frontiers in Molecular Biosciences, vol. 9, p. 535, Jun. 2022, 

[2] A. Sonn-Segev et al., “Quantifying the heterogeneity of macromolecular machines by mass photometry,” Nature Communications, vol. 11, no.  1, pp. 1–10, Dec. 2020, 

[3] V. Yin et al., “Probing Affinity, Avidity, Anticooperativity, and Competition in Antibody and Receptor Binding to the SARS-CoV-2 Spike by Single Particle Mass Analyses,” ACS Central Science, vol. 7, no.  11, pp. 1863–1873, Nov. 2021, 

[4] M. A. den Boer, S.-H. Lai, X. Xue, M. D. van Kampen, B. Bleijlevens, and A. J. R. Heck, “Comparative Analysis of Antibodies and Heavily Glycosylated Macromolecular Immune Complexes by Size-Exclusion Chromatography Multi-Angle Light Scattering, Native Charge Detection Mass Spectrometry, and Mass Photometry,” Analytical Chemistry, vol. 94, no. 2, pp. 892–900, Dec. 2021, 

[5] Y. Xu and S. Dang, “Recent Technical Advances in Sample Preparation for Single-Particle Cryo-EM,” Frontiers in Molecular Biosciences, vol. 9, p. 892459, Jun. 2022,