文獻(xiàn)解讀：單細(xì)胞多組學(xué)揭示人類癌細(xì)胞系的細(xì)胞異質(zhì)性

期刊：nature communications
影響因子：14.7
主要技術(shù)：scRNA-seq；scATAC-seq；癌細(xì)胞異質(zhì)性

背景
人類癌細(xì)胞系長期以來一直是癌癥進(jìn)展研究和藥物發(fā)現(xiàn)的工具，但由于癌細(xì)胞系的建立涉及到對適應(yīng)體外培養(yǎng)條件的腫瘤細(xì)胞的選擇，因此通常認(rèn)為癌細(xì)胞系是同質(zhì)的，無法保持原腫瘤的異質(zhì)性。然而，已經(jīng)證實(shí)細(xì)胞系可以進(jìn)化并發(fā)展成不同的細(xì)胞系。最近研究表明，通過使用單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）和熒光激活細(xì)胞分選（FACS）等技術(shù)可以在已建立的細(xì)胞系中檢測細(xì)胞多樣性。細(xì)胞系內(nèi)轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性促進(jìn)了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和耐藥的關(guān)鍵調(diào)控因子的發(fā)現(xiàn)，使這些細(xì)胞系可能成為研究藥物敏感性的分子機(jī)制和測試不同治療方案的合適模型。因此，了解常用人類癌細(xì)胞系的異質(zhì)性不僅將為基于細(xì)胞系的生物醫(yī)學(xué)研究提供重要信息，而且有助于確定合適的模型來研究特定癌癥表型的新機(jī)制。

腫瘤內(nèi)異質(zhì)性的起源通常上被認(rèn)為是遺傳方面的，但已經(jīng)擴(kuò)展到表觀遺傳學(xué)和微環(huán)境的急劇變化。盡管scRNA-seq可以有效地解決轉(zhuǎn)錄程序的異質(zhì)性，但它無法揭示潛在的驅(qū)動力，如表觀遺傳因素。為此，需要捕捉細(xì)胞間表觀遺傳景觀變化的技術(shù)。由于染色質(zhì)可及性在很大程度上可以反映轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、組蛋白修飾和DNA甲基化，并為基因調(diào)控機(jī)制提供了更深入的了解，轉(zhuǎn)座酶可及性染色質(zhì)單細(xì)胞測序分析（scATAC-seq）最近成為單細(xì)胞分辨率表觀基因組分析中使用最廣泛的分析方法。與scRNA-seq相比，scATAC-seq的一個(gè)主要優(yōu)勢是它提供了轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控基因的機(jī)制。scRNA-seq和scATAC-seq在癌癥標(biāo)本中的聯(lián)合應(yīng)用有助于識別精確的順式調(diào)控元件和靶基因，以及識別控制腫瘤發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

主要技術(shù)
scRNA-seq；scATAC-seq；癌細(xì)胞異質(zhì)性

研究結(jié)果
1. 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序揭示癌癥細(xì)胞系內(nèi)的潛在轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性
本研究選取了分布在9個(gè)譜系中以實(shí)體腫瘤為主的40個(gè)人癌細(xì)胞系和2個(gè)人正常細(xì)胞系進(jìn)行scRNA-seq分析（圖1a）。為了提高scRNA-seq實(shí)驗(yàn)的通量和降低成本，每次運(yùn)行scRNA-seq時(shí)，收集來自不同譜系的三株細(xì)胞系，然后根據(jù)其表達(dá)特征計(jì)算分配給相應(yīng)的細(xì)胞系（圖1b）�？偣搏@得了23,089個(gè)細(xì)胞，平均每個(gè)細(xì)胞系513個(gè)細(xì)胞，34,641個(gè)轉(zhuǎn)錄本，每個(gè)細(xì)胞捕獲5859個(gè)基因，顯示了該數(shù)據(jù)集的高質(zhì)量。為了進(jìn)一步檢驗(yàn)我們的scRNA-seq實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，在兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中分析了三個(gè)細(xì)胞系，包括Caco2、SCC-4和MDA-MB-231。結(jié)果顯示，同一細(xì)胞系的細(xì)胞在兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)運(yùn)行中測量是混合的（圖1c）。為了進(jìn)一步了解特定的癌癥譜系，分別在UMAP中繪制了乳腺癌和結(jié)直腸癌細(xì)胞系。對于乳腺癌細(xì)胞系，luminal A (LA)、luminal B (LB)、Her2+ (H)、三陰性A (TNA)、三陰性B (TNB)等相同分子亞型的細(xì)胞彼此相鄰（圖1d）。ESR1主要在LA和LB亞型中表達(dá)，而ERBB2在LB和H亞型中表達(dá)上調(diào)（圖1e）。此外，分析了其他已知的具有臨床相關(guān)性的基質(zhì)和上皮標(biāo)志物的表達(dá)（圖1f）。
 

圖 1

2. 單個(gè)細(xì)胞系的轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性
根據(jù)轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性的模式。在UMAP中，42個(gè)細(xì)胞系大致可以分為離散型和連續(xù)型兩種類型（圖2a）。由于這些細(xì)胞系中存在亞克隆，不同的亞簇在空間上被觀察到是離散的，而連續(xù)的亞簇在亞簇之間沒有明確的邊界�？偣灿�25個(gè)細(xì)胞系(57%)和17個(gè)細(xì)胞系(43%)分別屬于離散組和連續(xù)組（圖2b）。總體而言，離散/連續(xù)分類與多樣性得分相關(guān)性較好，其中多樣性得分最高的前25%的細(xì)胞系大多數(shù)是離散模式（圖2b），并且離散組的多樣性評分明顯高于連續(xù)組，這表明具有高度異質(zhì)性的細(xì)胞系通常派生出不同的亞類。然而，也有一些離散細(xì)胞系的多樣性評分較低，如SW620，而連續(xù)模式細(xì)胞系的多樣性評分較高，如SK-BR-3（圖2b）。對于前者，簇內(nèi)距離明顯小于簇間距離。因此，盡管在集體距離不是很大的情況下，該細(xì)胞系的多樣性得分較低，但根據(jù)分類，該細(xì)胞系呈現(xiàn)出離散的模式。對于后者，集體距離可以很大，而簇內(nèi)距離與簇間距離沒有顯著差異。綜上所述，兩個(gè)指標(biāo)顯示的細(xì)胞系內(nèi)異質(zhì)性表明，轉(zhuǎn)錄組多樣性可能受到不同亞克隆的存在以及細(xì)胞系內(nèi)在可塑性的影響，這兩個(gè)因素對細(xì)胞系內(nèi)異質(zhì)性的貢獻(xiàn)在單個(gè)細(xì)胞系中有所不同。
 

圖 2
 

3. 轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性形成的分子特征
接下來，將相似的NMF合并到NMF集群中，以確定40個(gè)癌細(xì)胞系中的復(fù)發(fā)性NMF程序。在3個(gè)以上的細(xì)胞系中鑒定出了12個(gè)異質(zhì)性激活的簇（圖2c）。隨后，基于同一簇內(nèi)單個(gè)程序之間的共有基因，其中出現(xiàn)在超過25%的程序中的基因被用作標(biāo)志基因。大多數(shù)細(xì)胞系共有的兩個(gè)最突出的簇與細(xì)胞周期有關(guān)，包括G1/S和G2/M程序（圖2c、d），這表明細(xì)胞周期變化是大多數(shù)細(xì)胞系中觀察到的轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性的主要原因。除了細(xì)胞周期相關(guān)的程序外，另外10個(gè)簇代表了各種關(guān)鍵的生物過程（圖2d）。

4. 人細(xì)胞系的泛癌scATAC-seq
進(jìn)一步使用scATAC-seq在單細(xì)胞分辨率下研究單個(gè)細(xì)胞系內(nèi)的表觀基因組異質(zhì)性。為了提高通量和降低scATACseq實(shí)驗(yàn)的成本，每次運(yùn)行scATACseq時(shí)，最多合并6個(gè)具有不同表達(dá)譜的細(xì)胞系，然后根據(jù)差異表達(dá)基因的可及性特征計(jì)算分配給相應(yīng)的細(xì)胞系（圖3a）。經(jīng)過質(zhì)量過濾，獲得54,597個(gè)高質(zhì)量的單核，每個(gè)細(xì)胞系的中位數(shù)為1170個(gè)核（范圍從203到4391個(gè)核），每個(gè)細(xì)胞核的中位數(shù)片段為11,702個(gè)。然后，我們匯總scATAC-seq譜來計(jì)算開放染色質(zhì)區(qū)域的基因組分布，結(jié)果顯示35.5%的ATAC峰定位在啟動子-近端區(qū)域(<±1.5 kb TSS)。使用UMAP將39個(gè)細(xì)胞系一起繪制，以呈現(xiàn)染色質(zhì)水平上的細(xì)胞系間距離，每個(gè)細(xì)胞系形成一個(gè)不同的簇（圖3b）。為了在表觀基因組水平上評估細(xì)胞系內(nèi)的異質(zhì)性，我們將細(xì)胞劃分為細(xì)胞系內(nèi)的初步集群。結(jié)果，62%的細(xì)胞系表現(xiàn)為無差別模式，38%的細(xì)胞系表現(xiàn)為差異模式（圖3c）�？傮w而言，不加區(qū)分差異分類與多樣性評分相關(guān)性良好，屬于差異組的細(xì)胞系的多樣性評分明顯高于不加區(qū)分組的細(xì)胞系（圖3d、e），這表明具有高度異質(zhì)性的細(xì)胞系通常派生出不同的亞簇。
 

圖 3

5. 與CNVs相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性
為明確觀察到轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性的起源，我們首先轉(zhuǎn)向惡性腫瘤常見的遺傳變異。使用scRNA-seq數(shù)據(jù)分析大規(guī)�？截悢�(shù)變異（CNV），計(jì)算了與正常細(xì)胞相比，每個(gè)位點(diǎn)周圍400個(gè)基因平均表達(dá)水平。該分析在40個(gè)（62.5%）癌細(xì)胞系中鑒定出25個(gè)CNV亞克�。▓D4a、b），表明CNV誘導(dǎo)的拷貝數(shù)變異在很大程度上有助于轉(zhuǎn)錄變異；17個(gè)（42.5%）細(xì)胞系未顯示相關(guān)性（圖4b）。在這25個(gè)細(xì)胞系中，分別有18個(gè)和7個(gè)細(xì)胞系表現(xiàn)為離散型和連續(xù)型，其余15個(gè)細(xì)胞系中分別有6個(gè)和9個(gè)細(xì)胞系表現(xiàn)為離散型和連續(xù)型。這表明，當(dāng)遺傳變異導(dǎo)致細(xì)胞系內(nèi)部異質(zhì)性時(shí)，細(xì)胞系傾向于以更離散的方式呈現(xiàn)異質(zhì)性轉(zhuǎn)錄組活性。然后，研究了位于CNV區(qū)域的基因是否有助于這些匹配細(xì)胞系的轉(zhuǎn)錄組變異性。結(jié)果顯示，差異表達(dá)的基因確實(shí)在CNV區(qū)域顯著富集（圖4c），表明遺傳變異是決定離散型細(xì)胞系細(xì)胞系內(nèi)異質(zhì)性的重要因素。這一事實(shí)也表明，即使對于那些具有不同模式的細(xì)胞系，也存在其他因素影響轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性。
 

圖 4

6. 染色質(zhì)可及性調(diào)控轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性
為了探索表觀基因組異質(zhì)性的機(jī)制，我們采用了包括ArchR28和ChromVAR30在內(nèi)的兩種方法，試圖推斷驅(qū)動細(xì)胞亞簇之間差異染色質(zhì)可及性的潛在轉(zhuǎn)錄因子，并重點(diǎn)研究了至少三種細(xì)胞系中出現(xiàn)的常見TF（圖5a）。參與調(diào)節(jié)IFN應(yīng)答的IRF1、IRF2、IRF9和STAT2，在LS 174T和hnscum - 02t細(xì)胞系中被異質(zhì)激活。然后，我們將重點(diǎn)放在分別在scRNA-seq和scATAC-seq數(shù)據(jù)中表現(xiàn)出離散和差異模式的7個(gè)細(xì)胞系上，試圖在兩個(gè)數(shù)據(jù)集之間匹配子簇。根據(jù)scATAC-seq數(shù)據(jù)計(jì)算基因評分矩陣，然后根據(jù)基因評分與基因表達(dá)的相似性進(jìn)行比對。結(jié)果，在7個(gè)細(xì)胞系中的3個(gè)，包括MDA-MB-231、RPMI 8226和SNB75，細(xì)胞亞簇可以在兩個(gè)數(shù)據(jù)集之間自如匹配（圖5b、c、d）。根據(jù)scATAC-seq和scRNA-seq數(shù)據(jù)，MDA-MB-231細(xì)胞分別聚為4個(gè)和3個(gè)亞組，其中scATAC-seq數(shù)據(jù)集的亞組2與scRNA-seq數(shù)據(jù)集的亞組1和2的混合匹配。對于SNB75,，scATAC-seq數(shù)據(jù)的3亞組與scRNA-seq數(shù)據(jù)的0和1亞組的混合匹配，其余scATAC-seq數(shù)據(jù)的亞組與scRNA-seq亞組呈一對一的相關(guān)性（圖5b、c、d）。這表明染色質(zhì)可及性和CNV的異質(zhì)性可以獨(dú)立促成轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性，對于這三種細(xì)胞系，染色質(zhì)可及性對轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性有很大貢獻(xiàn)。

為了進(jìn)一步探索驅(qū)動異質(zhì)染色質(zhì)可及性和RNA表達(dá)的分子機(jī)制，我們試圖推斷結(jié)合差異可及性染色質(zhì)區(qū)域的潛在TF。通過測量基因組特征集內(nèi)染色質(zhì)可及性的增益或損失來推斷TF活性，同時(shí)控制技術(shù)偏差，揭示潛在的TF在亞群之間表現(xiàn)出可變性（圖5e）。在MDA-MB-231中，發(fā)現(xiàn)FOXA2的活性在0亞組中特異性上調(diào)（圖5f），F(xiàn)OXA2的啟動子可及性在0亞組中也有所增加（圖5g）。我們隨后分析了FOXA2的下游靶標(biāo)，發(fā)現(xiàn)它們與“Kras_signaling_up”相關(guān)的基因更多相關(guān)（圖5h），這些基因在0亞組中表達(dá)上調(diào)（圖5i）。FOXA2可以在腫瘤發(fā)育過程中協(xié)同KrasG12D的激活。我們的結(jié)果表明FOXA2可能在控制異質(zhì)性中起重要作用。
 

圖 5

7. ecDNA分布誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性
最近的研究表明，癌基因擴(kuò)增既存在于染色體上，也存在于染色體外環(huán)狀dna (ecDNAs)上。由于在ecDNA中沒有著絲粒，與染色體擴(kuò)增子相比，它們不太穩(wěn)定，并且隨機(jī)地分離到子細(xì)胞，這可能是細(xì)胞異質(zhì)性的潛在驅(qū)動力。為了研究ecDNA對轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性的貢獻(xiàn)，我們首先建立了一種分析方法，該方法能夠利用scATAC-seq數(shù)據(jù)檢測高潛力的ecDNA區(qū)域，基于以下假設(shè):(1)ecDNA高度擴(kuò)增;(2) ecDNA具有更高的可及性。根據(jù)scATAC-seq數(shù)據(jù)，在每個(gè)單細(xì)胞中讀取覆蓋率呈現(xiàn)多個(gè)峰，其中第一個(gè)峰被認(rèn)為是兩個(gè)拷貝基因組區(qū)域的讀取覆蓋率，因此在這里定義為參考覆蓋率。為了尋找潛在的ecDNA片段，我們首先將整個(gè)基因組分成100,000 bp的bin，在歸一化測序深度后量化每個(gè)細(xì)胞中每個(gè)bin的讀取覆蓋率。然后，我們計(jì)算相對讀取覆蓋率，作為每個(gè)bin的覆蓋率與單元的參考覆蓋率的比率。由于ecDNA具有更高的可及性，相對覆蓋率至少為6的區(qū)域被定義為潛在的ecDNA片段，并通過TSS富集評分和細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步過濾。此外，考慮到scATAC-seq數(shù)據(jù)的稀疏性，如果由于實(shí)驗(yàn)和作圖偏差，該區(qū)域沒有被scATAC-seq讀取均勻和充分覆蓋，即使來自連續(xù)基因組區(qū)域的ecDNA也可以基于scATAC-seq數(shù)據(jù)檢測到多個(gè)ecDNA片段。因此，我們已經(jīng)鑒定的ecDNA片段的數(shù)量應(yīng)該高于在細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的不同ecDNA物種的數(shù)量。

為了解決這個(gè)問題，研究了它們在單個(gè)細(xì)胞系中不同潛在ecDNA片段之間的讀取覆蓋率的相關(guān)性，并將附近和高度相關(guān)的片段合并為潛在的ecDNA區(qū)域。然后，我們將合并的區(qū)域定義為潛在的ecDNA區(qū)域。如圖6a所示，在31個(gè)細(xì)胞系中，每個(gè)細(xì)胞系中檢測到229個(gè)潛在的ecDNA區(qū)域。我們的方法成功地發(fā)現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)證實(shí)的ecDNA，如K562中的chr9:130700000-131400000，其中ABL1和NUP214位于11中。致癌基因在潛在的ecDNA區(qū)域顯著富集（圖6a）。與沒有致癌基因的ecDNA相比，在單個(gè)細(xì)胞系中，含有致癌基因的ecDNA出現(xiàn)在更高比例的細(xì)胞中（圖6b），這表明含有致癌基因的ecDNA為細(xì)胞提供了生長優(yōu)勢，因此具有異質(zhì)性。考慮到ecDNA可以通過增加DNA拷貝數(shù)來增加轉(zhuǎn)錄RNA的數(shù)量，我們進(jìn)一步計(jì)算了ecDNA上的基因表達(dá)與ecDNA在每個(gè)細(xì)胞中的相對覆蓋數(shù)之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)它們是部分相關(guān)的（圖6c）。例如，位于SCC-4細(xì)胞系不同ecDNA中的基因KRT14和KRT17、LGALS2、SERPINE1和PCOLCE在SCC-4細(xì)胞系中以不同的三個(gè)亞簇特異性表達(dá)（圖6d）。鑒定這些基因高表達(dá)的細(xì)胞比例與含有這些基因的ecDNA的細(xì)胞比例高度相關(guān)（圖6e）。這一結(jié)果表明，ecDNA的高拷貝數(shù)有助于ecDNA中基因的高表達(dá)。為了進(jìn)一步評估ecDNA對轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性的影響，我們選擇了MDA-MB231，其scATAC-seq和scRNA-seq數(shù)據(jù)可以整合（圖5b-d），以反映scRNA-seq數(shù)據(jù)分析的UMAP中ecDNA的拷貝數(shù)。如圖6f所示，Chr12: 5900000_7200000 ecDNA在亞簇0中特別富集。同時(shí)，位于該ecDNA上的CD9、LTBR、PTMS、TPI1、ENO2、C12orf57等基因在亞簇0中也有高表達(dá)（圖6g）， CD9是亞簇0的頂級標(biāo)記基因之一。這些結(jié)果表明，ecDNAs可以影響基因表達(dá)，從而影響細(xì)胞聚集。
 

圖 6

8. 低氧處理重塑細(xì)胞系內(nèi)異質(zhì)性
腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)動態(tài)的過程，伴隨著微環(huán)境的劇烈變化。微環(huán)境在腫瘤進(jìn)展、治療抵抗和轉(zhuǎn)移形成中發(fā)揮重要作用，并增加了另一層調(diào)控，可驅(qū)動腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。在這里，我們試圖評估這些轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性在不同條件下是靜態(tài)的還是可塑性的。鑒于在實(shí)體瘤中，腫瘤細(xì)胞經(jīng)常處于不同程度的缺氧狀態(tài)，我們選擇缺氧處理作為環(huán)境應(yīng)激進(jìn)行擾動，結(jié)果顯示，缺氧處理后，低氧相關(guān)基因發(fā)生了顯著變化。為了匹配缺氧治療前后的細(xì)胞亞群，我們觀察到兩種類型的相關(guān)模式:(1)細(xì)胞簇在缺氧處理前后是一對一匹配的，這表明缺氧處理沒有改變細(xì)胞簇之間的差異，如ZR-75-1（圖7a）；(2)一些細(xì)胞簇從一個(gè)分裂到多個(gè)，這表明一個(gè)細(xì)胞簇內(nèi)的細(xì)胞可能對缺氧有不同的反應(yīng)，如DLD-1和SW620（圖7c、e）。為了確定在一個(gè)亞群中引起對缺氧應(yīng)激差異反應(yīng)的潛在機(jī)制，我們重點(diǎn)研究了在缺氧下分裂的亞群。例如，在缺氧條件下，DLD-1的子簇0分為2個(gè)簇（圖7c）。我們檢查了集群0和0-1/0-2之間的差異表達(dá)基因(DEGs):集群0和0-1之間變化最大的基因是缺氧相關(guān)基因，如BNIP3L、SLC2A1和ERO1A，而集群0和0-2之間的缺氧相關(guān)DEGs有限（圖7d）。這表明原簇0中存在兩組細(xì)胞對缺氧的反應(yīng)不同，但在缺氧處理前的轉(zhuǎn)錄水平差異不明顯。同樣，在SW620細(xì)胞中，簇0被分為簇0-1和簇0-2（圖7e）；盡管所有細(xì)胞都對缺氧有反應(yīng)，但簇0-1中的細(xì)胞顯示了與EMT相關(guān)的其他基因的變化（圖7f）。
 

圖 7

圖 8