文獻(xiàn)解讀：小鼠模型在揭示乳酸化如何促進(jìn)腫瘤發(fā)生研究中的應(yīng)用

眾所周知，代謝異常是癌癥的一大特征。即使在氧氣充足的情況下，大多數(shù)癌細(xì)胞也會(huì)沉迷于有氧糖酵解。這種被稱(chēng)為“Warburg效應(yīng)”的代謝改變導(dǎo)致乳酸等糖酵解中間產(chǎn)物升高，以支持細(xì)胞增殖。

有證據(jù)表明，乳酸參與調(diào)節(jié)多個(gè)生物過(guò)程，如免疫細(xì)胞分化、腫瘤免疫監(jiān)視、纖維化等，并通過(guò)乳酸化（lactylation）的表觀遺傳修飾調(diào)節(jié)基因表達(dá)。盡管乳酸可以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行共價(jià)修飾，但細(xì)胞內(nèi)乳酸如何被檢測(cè)到并轉(zhuǎn)化為乳酸化，具體機(jī)制仍不清楚。

近日，蘇州大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院周芳芳教授領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，AARS1作為乳酸感知器介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中的全局賴(lài)氨酸乳酸化。p53蛋白中特定賴(lài)氨酸殘基的乳酸化會(huì)降低p53的腫瘤抑制作用。這項(xiàng)研究成果于2024年4月發(fā)表在頂級(jí)期刊《Cell》上，幫助人們更好地了解乳酸化與腫瘤發(fā)生之間的關(guān)系。
 

圖片來(lái)源：《Cell》
（https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.04.002）

研究材料與方法
在這項(xiàng)研究中，研究人員將MMTV-PyMT/MMTV-Cre⁺小鼠分別與賽業(yè)生物提供的Ldha^fl/fl小鼠和Aars^fl/fl小鼠雜交，以生成條件性基因敲除小鼠。他們開(kāi)展了全基因組CRISPR篩選，以鑒定負(fù)責(zé)乳酸化的蛋白質(zhì)，并通過(guò)分子對(duì)接和質(zhì)譜分析等數(shù)據(jù)，確定了AARS1與乳酸或p53的相互作用。

技術(shù)路線
01 通過(guò)乳腺癌數(shù)據(jù)集和小鼠模型來(lái)評(píng)估乳酸與p53之間的關(guān)系
02 通過(guò)CRISPR篩選確定AARS1介導(dǎo)賴(lài)氨酸乳酸化，且功能保守
03 利用相互作用和突變體分析AARS1介導(dǎo)乳酸化的具體機(jī)制
04 測(cè)試β-丙氨酸是否能抑制乳酸與AARS1的結(jié)合以及腫瘤發(fā)生

研究結(jié)果
1 腫瘤來(lái)源的乳酸是p53的天然抑制劑
研究人員在評(píng)估TCGA乳腺癌數(shù)據(jù)集后發(fā)現(xiàn)，對(duì)于攜帶野生型p53的患者，血清乳酸水平高對(duì)應(yīng)著p53信號(hào)通路評(píng)分明顯較低，這表明腫瘤中的乳酸可能會(huì)抑制p53的功能。為了研究乳酸在體內(nèi)的作用，他們?cè)诮臃NMMTV-PyMT腫瘤細(xì)胞的小鼠體內(nèi)注射乳酸鈉。結(jié)果表明注射乳酸鈉會(huì)導(dǎo)致腫瘤更早形成，體積明顯增大，且腫瘤內(nèi)p53活性明顯受到抑制。

乳酸脫氫酶A（LDHA）將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸，其高表達(dá)與乳腺癌患者的生存率低有關(guān)。為此，研究人員將MMTV-PyMT/MMTV-Cre⁺小鼠與Ldha^fl/fl小鼠（由賽業(yè)生物提供）雜交，造成動(dòng)物乳腺上皮中Ldha的組成型缺失。值得注意的是，LDHA的缺失導(dǎo)致腫瘤形成延遲、腫瘤乳酸和腫瘤負(fù)荷降低，且p53活性增加。此外，阻斷乳酸的產(chǎn)生可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞中p53靶基因的表達(dá)顯著增加。這些結(jié)果表明，腫瘤來(lái)源的乳酸是p53的天然抑制劑，可促進(jìn)p53乳酸化。

2 AARS1介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中的賴(lài)氨酸乳酸化
為了鑒定負(fù)責(zé)p53乳酸化的蛋白質(zhì)，研究人員在HeLa細(xì)胞中開(kāi)展了全基因組CRISPR篩選。在此次篩選中，丙氨酰tRNA合成酶1（AARS1）被確定為最強(qiáng)的候選基因（圖1）。之后，他們分析了全局賴(lài)氨酸乳酸化組，發(fā)現(xiàn)AARS1敲降抑制了乳酸誘導(dǎo)的乳酸化組；相反，過(guò)表達(dá)AARS1則強(qiáng)烈加強(qiáng)了整體的賴(lài)氨酸乳酸化組，表明AARS1介導(dǎo)了細(xì)胞中的全局賴(lài)氨酸乳酸化。

AARS1在多個(gè)物種中是保守的，包括大腸桿菌。細(xì)菌對(duì)應(yīng)酶EcAlaRS的過(guò)表達(dá)也加強(qiáng)了整體的賴(lài)氨酸乳酸化組（圖1）。在比較人類(lèi)HsAlaRS和細(xì)菌EcAlaRS后，他們發(fā)現(xiàn)兩者的目標(biāo)位點(diǎn)和蛋白質(zhì)存在大規(guī)模重疊。根據(jù)這些結(jié)果，研究人員推測(cè)AARS1可能在催化賴(lài)氨酸乳酸化過(guò)程中發(fā)揮了古老的作用，從原核生物到哺乳動(dòng)物，這種作用都是保守的。
 

圖1 全基因組CRISPR篩選確定AARS1介導(dǎo)了賴(lài)氨酸乳酸化^[1]

3 AARS1在ATP存在的情況下促進(jìn)賴(lài)氨酸乳酸化
那么，AARS1如何介導(dǎo)乳酸化呢？研究人員發(fā)現(xiàn)，EcAlaRS和HsAlaRS可直接與乳酸結(jié)合，以乳酸作為底物直接催化乳酸化。分子對(duì)接分析表明，HsAlaRS中的保守殘基（M46、R77、N216和D239）和EcAlaRS中的保守殘基（M43、R69、W170、N212和D235）與乳酸形成直接接觸。不過(guò)，只有在乳酸和ATP同時(shí)存在的情況下，AARS1才會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞裂解液中的賴(lài)氨酸乳酸化。

質(zhì)譜數(shù)據(jù)表明，AARS1與p53相互作用；體外分析也表明，HsAlaRS和EcAlaRS直接與p53結(jié)合。p53蛋白的第120位賴(lài)氨酸（K120）和第139位賴(lài)氨酸（K139）被乳酸化（圖2）。在體外，野生型的HsAlaRS和EcAlaRS（而不是乳酸或ATP結(jié)合缺陷突變體）在K120和K139處對(duì)p53進(jìn)行乳酸化，這些反應(yīng)可被β-丙氨酸抑制。

據(jù)此，研究人員提出：首先，AARS1中的乳酸被ATP分子激活，形成中間產(chǎn)物乳酸-AMP，并釋放出無(wú)機(jī)焦磷酸（PPi）；其次，活化的乳酸與賴(lài)氨酸受體端共價(jià)連接，并釋放出AMP。與此相一致的是，在將乳酸和ATP與AARS1共同孵育后，他們檢測(cè)到乳酸-AMP的形成和PPi的釋放。因此，他們推斷AARS1通過(guò)催化ATP依賴(lài)性的乳酸-AMP形成，將乳酸轉(zhuǎn)移到目標(biāo)蛋白的賴(lài)氨酸殘基上（圖2）。
 

圖2 AARS1催化ATP依賴(lài)性的乳酸與賴(lài)氨酸結(jié)合^[1]

4 p53的位點(diǎn)特異性乳酸化會(huì)削弱其DNA結(jié)合能力
接下來(lái)，研究人員分析了位于DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的K120和K139的乳酸化如何抑制p53的活性。他們生成了p53變體，這種變體攜帶了組成型乳酸化的賴(lài)氨酸殘基。與非乳酸化p53（p53NonLac）相比，p53Lac與含有p53應(yīng)答元件的DNA（p53RE-DNA）的親和力大大降低，這會(huì)抑制p53的液-液相分離（LLPS）和轉(zhuǎn)錄活性。體外和體內(nèi)分析證實(shí)了這些結(jié)果，表明位點(diǎn)特異性的乳酸化會(huì)降低p53的腫瘤抑制作用。

之前的研究發(fā)現(xiàn)p53存在與癌癥相關(guān)的突變熱點(diǎn)，包括K120N、K120E、K139T、K139Q等。賴(lài)氨酸突變?yōu)樘於�酰胺、蘇氨酸、谷氨酰胺，尤其是谷氨酸，會(huì)降低其正電荷，并模擬相應(yīng)賴(lài)氨酸殘基的乳酸化。研究人員發(fā)現(xiàn)，這些突變體與p53RE-DNA的結(jié)合親和力降低，尤其是K120E和K139E，而且突變體不能抑制細(xì)胞增殖、克隆形成和異種移植腫瘤生長(zhǎng)，進(jìn)一步證實(shí)了p53乳酸化在腫瘤進(jìn)展中的潛在作用。

5 β-丙氨酸可拮抗AARS1介導(dǎo)的p53乳酸化
AARS1在許多腫瘤類(lèi)型中的表達(dá)都升高，并與WT p53患者的生存率不佳有關(guān)。為此，研究人員將Aars^fl/fl小鼠（賽業(yè)生物提供）與MMTV-PyMT/MMTV-Cre⁺小鼠雜交，生成乳腺上皮細(xì)胞缺失AARS的小鼠，并評(píng)估AARS1表達(dá)減少的影響。與野生型小鼠相比，AARS1表達(dá)減少的小鼠患腫瘤的時(shí)間更晚，且腫瘤負(fù)荷也更低。在這些小鼠的腫瘤中，p53在K120和K139處的乳酸化減少。這些結(jié)果表明，AARS1在體內(nèi)介導(dǎo)p53失活并導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。

考慮到β-丙氨酸（一種常用的運(yùn)動(dòng)補(bǔ)充劑）是乳酸的類(lèi)似物，他們推測(cè)其能破壞乳酸與AARS1的結(jié)合。在動(dòng)物模型中，β-丙氨酸處理可適度抑制細(xì)胞增殖、克隆形成和異種移植腫瘤生長(zhǎng)。多柔比星（激活p53的癌癥治療藥物）可以增強(qiáng)上述效果。經(jīng)過(guò)β-丙氨酸和多柔比星處理，小鼠壽命顯著延長(zhǎng)。由此可以推斷，β-丙氨酸可防止乳酸化依賴(lài)性的p53失活，表明它具有治療潛力。

研究結(jié)論
 

圖3 AARS1介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中的p53乳酸化并促進(jìn)腫瘤發(fā)生的示意圖^[1]

總的來(lái)說(shuō)，這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)腫瘤產(chǎn)生的乳酸通過(guò)乳酸化對(duì)抗p53。AARS1是一種乳酸感知器，負(fù)責(zé)全局賴(lài)氨酸乳酸化。該研究還確定p53的K120和K139是AARS1的真正靶點(diǎn)，并證明乳酸化會(huì)阻礙p53液-液相分離、DNA結(jié)合和轉(zhuǎn)錄激活，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生（圖3）。研究人員認(rèn)為，全面了解AARS1的功能及其功能失調(diào)的后果有望從機(jī)理上認(rèn)識(shí)多種人類(lèi)疾病。

參考文獻(xiàn)：
[1]Zong et al., Alanyl-tRNA synthetase, AARS1, is a lactate sensor and lactyltransferase that lactylates p53 and contributes to tumorigenesis, Cell (2024), https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.04.002

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Ldha flox小鼠

小鼠福利，限定發(fā)放中~
品系名稱(chēng)：
C57BL/6JCya-Ldha^em1flox/Cya
品系編號(hào)：
CKOCMP-16828-Ldha-B6J-VA
產(chǎn)品編號(hào)：
S-CKO-03369
應(yīng)用方向：
代謝,癌癥,骨骼,遺傳,腸胃,精神科
 

Aars KO小鼠

小鼠福利，限定發(fā)放中~
品系名稱(chēng)：
C57BL/6JCya-Aars1^em1/Cya
品系編號(hào)：
KOCMP-234734-Aars1-B6J-VA
產(chǎn)品編號(hào)：
S-KO-15705
應(yīng)用方向：
代謝,骨骼,遺傳,腸胃,精神科,罕見(jiàn)病
 

Aars flox小鼠

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品系名稱(chēng)：
C57BL/6JCya-Aars1^em1flox/Cya
品系編號(hào)：
CKOCMP-234734-Aars1-B6J-VA
產(chǎn)品編號(hào)：
S-CKO-07765
應(yīng)用方向：
代謝,骨骼,遺傳,腸胃,精神科,罕見(jiàn)病