血管生成實驗步驟及常見問題解析

 
“1971 年，Judah Folkman 教授提出 “腫瘤生長和轉(zhuǎn)移依賴于血管新生” 理論，認(rèn)為新血管的形成對于腫瘤生長和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。”

腫瘤細(xì)胞需要新生血管來提供營養(yǎng)和氧氣，以維持其持續(xù)生長和擴(kuò)散。研究腫瘤細(xì)胞的血管生成能力和血管侵襲能力對于了解腫瘤生物學(xué)機(jī)制，以及發(fā)展抗腫瘤治療策略具有重要意義。成血管實驗可以模擬腫瘤微環(huán)境，評估腫瘤細(xì)胞及其周圍細(xì)胞對血管生成的影響。
 
成血管實驗怎樣設(shè)計？
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TIPS：
1. 在成血管前需要饑餓培養(yǎng)細(xì)胞，以增加細(xì)胞對生長因子和刺激因子的敏感性，促進(jìn)血管生成。常用于成血管研究的細(xì)胞類型有 HUVEC、HMVEC、HMEC-1 等
2. 在成血管實驗中通常有對照組與添加促進(jìn)或抑制血管生成的藥物進(jìn)行對比，以研究該藥物對腫瘤細(xì)胞成血管的影響。
3. 一般成血管實驗使用的基質(zhì)膠濃度建議至少 10mg/mL，更高濃度的基質(zhì)膠效果會縮短血管開始形成的時間，并且血管形成時間更長，易于確定觀察時間窗口。
   
NEST 的 GelNestTM基質(zhì)膠取自小鼠腫瘤組織，可增強(qiáng)細(xì)胞粘附、分化和增殖。它模擬生理環(huán)境，是組織工程和細(xì)胞培養(yǎng)研究的理想選擇，尤其適用于類器官和干細(xì)胞培養(yǎng)。它還有助于癌癥研究，如侵襲、血管生成和體內(nèi)腫瘤形成實驗。

成血管專用款基質(zhì)膠濃度在 12-14mg/mL，相比標(biāo)準(zhǔn)款與低因子款更適合用于體外成血管實驗。  
Part.01 GelNestTM成血管專用基質(zhì)膠包被
1. 在 96 孔板的底部均勻鋪上 50µL GelNest™基質(zhì)膠原液（推薦 211492，濃度>12mg/mL），添加時避免氣泡產(chǎn)生。24 孔每孔約加 280μL，其他孔板按培養(yǎng)面積大小增減。（為防止基質(zhì)膠粘附在槍頭內(nèi)壁， 在吸取基質(zhì)膠前可用槍頭吹吸一次 FBS，對槍頭內(nèi)壁進(jìn)行 FBS 潤洗。）
2. 將培養(yǎng)板置于 37℃培養(yǎng)箱 30 至 60 分鐘。若有液體剩余，可用移液槍輕輕吸出。
3. 包被好的培養(yǎng)板請盡快使用。
 
Part.02 HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)與成血管
1. 將 HUVEC 細(xì)胞培養(yǎng)至 70-80%的匯合度，原代細(xì)胞代數(shù)應(yīng)該在 5 代以內(nèi)。
2. 將完全培養(yǎng)基替換成饑餓細(xì)胞用培養(yǎng)基：含 0.2% FBS（減血清）、2mM L-谷氨酰胺、1mM 丙酮酸鈉、100U/mL 青霉素和 100µg/mL 鏈霉素的 DMEM 培養(yǎng)基，饑餓培養(yǎng) 24 小時。
3. 胰酶消化 HUVEC 細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。
4. 將 5x104個 HUVEC 細(xì)胞加入含基質(zhì)膠的 96 孔板的單孔中，每孔體積控制在 200µL。將 96 孔板放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
5. 血管樣網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)預(yù)計將在 3 至 12 小時內(nèi)形成。首次實驗請每隔一小時觀察一次，以防血管結(jié)構(gòu)繼續(xù)分化，錯過觀察窗口。 
 
Part.03 染色與觀察
1. 血管樣網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可以直接用相差顯微鏡觀察，也可以用以下步驟進(jìn)行熒光染色。
2. 小心去除培養(yǎng)基，避免破壞血管結(jié)構(gòu)。加入200μL HBSS緩沖液潤洗兩次，并除去。
3. 加入1/1000濃度的Calcein AM（綠色）培養(yǎng)基進(jìn)行染色。
4. 使用熒光顯微鏡對細(xì)胞進(jìn)行成像，并記錄分析血管網(wǎng)絡(luò)的形態(tài)和特征。  
可觀察到在 GelNestTM 基質(zhì)膠中血管樣網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成良好。  
1.  應(yīng)該采用何種培養(yǎng)基稀釋基質(zhì)膠？
建議使用不加雙抗、不加胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基稀釋基質(zhì)膠。
 
2.  如何使鋪膠更均勻？
槍頭要垂直于內(nèi)孔的正上方，防止有基質(zhì)膠流經(jīng)孔壁殘留。
若是孔的底部沒有鋪滿基質(zhì)膠，可以晃動一下96孔板，使底部鋪膠均勻。
若還是沒有均勻鋪滿底部，可用槍頭稍微攪動一下。
 
3. HUVEC必須用專用培養(yǎng)基嗎？能不能用普通培養(yǎng)基？
(1) 若使用普通培養(yǎng)基需要添加生長因子，常見的有ECGF/ECGF，ECGF。
(2) 普通培養(yǎng)基+生長因子的方式價格較貴，建議使用專用ECM內(nèi)皮專用培養(yǎng)基。
 
4. HUVEC細(xì)胞系換液第二天為何出現(xiàn)空泡化？如何解決空泡化問題？
可能原因：
(1) 培養(yǎng)液的pH值與細(xì)胞正常所需pH值差別太大，細(xì)胞代謝異常導(dǎo)致空泡化；
(2) 在細(xì)胞培養(yǎng)過程中由于血清濃度不夠、藥物作用、外界刺激等情況，導(dǎo)致細(xì)胞代謝出現(xiàn)問題，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致出現(xiàn)細(xì)胞空泡化的情況。
解決方法：
(1)測定完全培養(yǎng)基的pH，看其酸堿性是否適宜。多數(shù)細(xì)胞適宜的pH范圍為7.2-7.4。
(2)若培養(yǎng)基或血清是已開封且存放了很久，建議使用新鮮的完全培養(yǎng)基給細(xì)胞換液；若都是新開封的，建議使用新批次的基礎(chǔ)培養(yǎng)基或血清來配制培養(yǎng)液，給細(xì)胞換液并進(jìn)行觀察。
 
5. HUVEC培養(yǎng)過程中出現(xiàn)聚團(tuán)如何處理？
聚團(tuán)可能是因為培養(yǎng)板親水性差或者血清中的促貼壁因子不足。
解決方法：
(1) 培養(yǎng)瓶使用前一天使用明膠包被。
包被方法：以T25瓶為例，取用5mL明膠放入T25瓶中，37℃放置30分鐘以上，將多余的明膠吸出。
(2) 提高培養(yǎng)液中基質(zhì)膠濃度。
(3) 使用ECM內(nèi)皮專用培養(yǎng)基進(jìn)行配置。
 
6.  如何判斷加入的基質(zhì)膠體積是否合適？
在孔板下方放置一張格子紙(如圖)，垂直透過每個孔觀察：
(1) 如果觀察到的格子比實際尺寸小，基質(zhì)膠加入的體積過少；
(2) 如果觀察到的格子比實際尺寸大，基質(zhì)膠加入的體積過多；
(3) 如果觀察到的格子與實際尺寸一致，基質(zhì)膠加入的體積適合。  
7.  如何解決成管實驗中細(xì)胞不能形成連續(xù)的網(wǎng)格的問題？
建議使用3-5代狀態(tài)較好且融合度70%-80%的HUVEC細(xì)胞進(jìn)行成管試驗，此時的細(xì)胞成管能力較強(qiáng)。
在顯微鏡下邊觀察邊使用胰酶消化細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞變圓時及時終止消化過程。消化過度會影響成管效果。
盡可能保證細(xì)胞數(shù)量約為3萬個/孔，細(xì)胞數(shù)量過少會使細(xì)胞無法形成連續(xù)的網(wǎng)絡(luò)。
選擇低生長因子基質(zhì)膠進(jìn)行成管實驗時，可考慮在培養(yǎng)基中添加生長因子，刺激細(xì)胞形成網(wǎng)絡(luò)狀。
 
8.  細(xì)胞鋪板數(shù)量如何確定？
由于計數(shù)方式的差異可能導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量的差異，可進(jìn)行預(yù)實驗測試合適的細(xì)胞數(shù)鋪板，適宜的細(xì)胞數(shù)量如下圖：
   
9. 成管實驗需要幾個小時？小管形成后為何會塌縮？
成管時間與細(xì)胞狀態(tài)密切相關(guān)。細(xì)胞狀態(tài)好時，2-3小時開始成管，細(xì)胞狀態(tài)較差時，可能18-24h成管。建議第一次實驗時，每隔一個小時觀察一次。

成管時間取決于培養(yǎng)基中血管生成因子的濃度。腫瘤條件培養(yǎng)基中血管生成因子較豐富，容易成管，而基礎(chǔ)培養(yǎng)基所需要的成管時間較久。

如果使用原代內(nèi)皮細(xì)胞而非永生化細(xì)胞，開始成管的時間會延遲數(shù)個小時。

小管形成后有塌縮可能是培養(yǎng)時間過久，內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡。
 
10.  血管形成實驗中使用的凝膠是否需要含酚紅？
對于使用相差顯微鏡，酚紅不會干擾圖片，并且由于其顏色，處理更容易。
然而，當(dāng)使用熒光顯微鏡時，酚紅可能會干擾探頭的波長。在這種情況下，最好使用無酚紅凝膠。