多糖結(jié)合疫苗的純化

多糖結(jié)合疫苗是一類將多糖與蛋白質(zhì)載體結(jié)合起來(lái)預(yù)防性疫苗。單純的莢膜多糖疫苗不能誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫記憶抗體，但將多糖與載體蛋白結(jié)合后可誘導(dǎo)產(chǎn)生記憶性抗體，有效提高疫苗的免疫原性。尤其是對(duì)于2歲以下的嬰幼兒，因?yàn)樗麄兊拿庖呦到y(tǒng)尚未完全成熟，對(duì)多糖疫苗的反應(yīng)較弱。此類疫苗主要用于預(yù)防由具有多糖莢膜的細(xì)菌引起的疾病，如b型流感嗜血桿菌（Hib）、肺炎鏈球菌和腦膜炎奈瑟菌等。結(jié)合疫苗的多糖部分通常來(lái)自病原體的多糖，具有高度的種屬特異性，載體蛋白部分通常選擇具有強(qiáng)免疫原性的蛋白質(zhì)，如破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素或其突變體CRM197等。
 
以肺炎多糖結(jié)合疫苗為例，肺炎鏈球菌是人類致病率及死亡率極高的致病菌之一，嚴(yán)重威脅人類的生命健康。它是一類革蘭染色陽(yáng)性致病菌，首次分離于1881年。肺炎鏈球菌表面黏液層化學(xué)成分為多糖的莢膜，是肺炎鏈球菌主要的致病物質(zhì)，具有抗原性，根據(jù)其結(jié)構(gòu)特異性可將肺炎鏈球菌分為90多個(gè)血清型，其中10種最常見的血清型（1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F、23F）導(dǎo)致了全球62%相關(guān)的侵襲性疾病。2000年由輝瑞公司研制的Prevenar成為首個(gè)上市的7價(jià)肺炎結(jié)合疫苗，由7種血清型的莢膜多糖（血清型 4、6B、9V、14、18C、19F、23F）與白喉類毒素突變體 CRM197 共價(jià)結(jié)合制成。目前，多糖結(jié)合疫苗，特別是13價(jià)肺炎球菌多糖結(jié)合疫苗（PCV13），在中國(guó)市場(chǎng)上已有幾款產(chǎn)品成功上市，打破了進(jìn)口疫苗的壟斷地位。

  「直接結(jié)合法」
直接結(jié)合法是利用肺炎鏈球菌莢膜多糖表面固有的官能團(tuán)與蛋白載體表面的官能團(tuán)進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)，多糖表面豐富的官能團(tuán)為與蛋白的直接結(jié)合提供了便利。還原胺化法是典型的直接結(jié)合法，肺炎鏈球菌莢膜多糖表面的鄰位羥基經(jīng)水解或強(qiáng)氧化劑（如高碘酸鈉）氧化后形成末端醛基，可與蛋白表面的氨基形成席夫堿結(jié)構(gòu)，在還原劑（如氰基硼氫化鈉）存在下轉(zhuǎn)化為較為穩(wěn)定的C-N 結(jié)構(gòu)結(jié)合物。
 
「間接結(jié)合法」
間接結(jié)合法是利用鏈接劑將肺炎鏈球菌莢膜多糖與載體蛋白進(jìn)行共價(jià)結(jié)合的方法，該方法可降低空間屏蔽作用，從而影響結(jié)合物的免疫原性。目前，比較常用的連接劑是己二酰肼，兩端的-NH₂ 可在碳二亞胺存在時(shí)分別與多糖上的氰酸酯基（表面羥基經(jīng)溴化氰或CDAP活化后獲得）和載體蛋白的羧基反應(yīng)鍵合。

 
「多糖純化」
將收獲的上游發(fā)酵液，進(jìn)行超速離心或進(jìn)行深層過濾，除去大的菌體碎片與可溶性雜質(zhì)。隨后采用超濾與MMA/IEX層析處理，進(jìn)行換液與濃縮并除去HCD與HCP，最終完成多糖的制備。
 
百林科MaXtar^® MMA 多模式填料為高流速改良瓊脂糖基架層析介質(zhì)，由多個(gè)不同性質(zhì)的基團(tuán)組成：氨基、氫鍵和疏水基團(tuán)。
 
款型包括：MaXtar^® MMA多模式填料；MaXtar^® MMA HR 多模式填料。

• 高流速改良瓊脂糖基架層析介質(zhì)
• 耐受范圍廣，化學(xué)穩(wěn)定性好
• 由多個(gè)不同性質(zhì)的基團(tuán)組成：氨基、氫鍵和疏水基團(tuán)

百林科MaXtar^® MMA 多模式填料在肺炎多糖純化中可實(shí)現(xiàn)高回收率并且質(zhì)量合格的工藝替換。
「結(jié)合純化」
將多糖進(jìn)行水解、活化、衍生、超濾后與蛋白載體通過直接或間接法結(jié)合。多糖與蛋白穩(wěn)定結(jié)合后，再經(jīng)過超濾與SEC/CHT層析工藝最終完成肺炎多糖結(jié)合疫苗的下游純化。
 
結(jié)合疫苗不論在多糖純化階段還是結(jié)合后純化階段都要大量采用超濾工藝進(jìn)行換液與除雜，以期除去HCD與HCP亦或是游離的多糖及蛋白，以及活化與結(jié)合時(shí)引入的氧化劑或還原劑。百林科FiltraLinX^® 桌面手動(dòng)盒式膜超濾系統(tǒng)可對(duì)超濾工藝全流程監(jiān)控，實(shí)現(xiàn)0.1-2.5m²不同過濾面積需求，是實(shí)驗(yàn)室小試，中試，及部分品種GMP階段的理想選擇。
 
多糖結(jié)合疫苗純化后期面對(duì)難以去除雜質(zhì)，通常采用SEC/CHT層析手段。
 
Chromstar^® 4FF/6FF 是高度交聯(lián)（4%/6%）的瓊脂糖基架凝膠過濾層析介質(zhì)。

• 高流速瓊脂糖基架層析介質(zhì)
• 非特異性吸附低，化學(xué)穩(wěn)定性好
• 適用于多糖、重組蛋白、病毒等大分子物質(zhì)分離  

BARONHAP™ 羥基磷灰石層析介質(zhì)：

無(wú)機(jī)純相層析介質(zhì)，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，兼具陽(yáng)離子交換、鈣金屬親和、羥基等多種分離模式，款型包括：BARONHAP™ type I ；BARONHAP™ type II。

• 獨(dú)特的分離特性
• 增加了使用壽命
• 高動(dòng)態(tài)結(jié)合載量
• 良好的批次重復(fù)性
• 無(wú)機(jī)純相層析介質(zhì)，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定
• 兼具陽(yáng)離子交換、鈣金屬親和、羥基等多種分離模式

 
多糖結(jié)合疫苗血清型眾多例如PCV13，PCV23。為防止各血清型之間交叉污染可采用百林科BioHub^® 一次性灌裝系統(tǒng)防止交叉污染。
 
BioHub^® 一次性灌裝系統(tǒng)是一種預(yù)先滅菌的，且隨時(shí)可以使用的一次性灌裝方式，包含一次性攪拌袋、無(wú)菌儲(chǔ)液袋、灌裝袋、一次性囊式過濾器、灌裝管路、一次性無(wú)菌連接器、斷開器和一次性灌裝針等組件。百林科為客戶提供高質(zhì)量的耗材以及服務(wù)和支持，以最大限度地降低客戶的風(fēng)險(xiǎn)。
 
 

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