文獻解讀：單細胞測序在帕金森病小鼠模型腦單細胞圖譜分析中的應用
期刊：J Genet Genomics
影響因子：5.72
主要技術：華大C4單細胞測序
導語
帕金森病(PD)是一種神經退行性疾病，導致運動執(zhí)行能力受損。PD的發(fā)病機制已經得到了廣泛的研究，要么局限于轉錄組水平，要么局限于某些細胞類型，這無法捕捉到細胞異質性和不同細胞類型之間的內在相互作用。在這里，我們報告了單核RNA-seq在中腦、紋狀體和小腦中的應用。PD小鼠模型，以及匹配的對照組，產生了由46,174個個體細胞組成的PD模型小鼠大腦的第一個單細胞轉錄組圖譜，此外，本研究全面描述了帕金森病病理中的功能障礙，包括NF-kB活性的升高、離子通道成分的改變、蛋白質穩(wěn)態(tài)網絡的紊亂和谷氨酸能信號通路的失調。值得注意的是，本研究確定了與帕金森病風險基因密切相關的多種細胞類型。總的來說，我們的研究提供了有價值的資源，有助于系統地解析帕金森病發(fā)病的分子機制，這有助于開發(fā)新的診斷和治療帕金森病的方法。
技術服務
華大C4單細胞測序平臺
研究結果
1. 小腦、中腦和紋狀體的單細胞核分析
從6個月大的α-synuclein A53T轉基因小鼠（α-syn-A53T）和匹配的野生型小鼠（WT）中解剖小腦、中腦和紋狀體樣本，進行單核測序（圖1A）。為了對主要細胞類型進行分類，我們結合了來自α-syn-A53T和WT的細胞（中腦：8809個來自α-syn-A53T的細胞和5202個來自WT的細胞；紋狀體：12780個來自α-sin-A53T的細胞和5441個來自WT；小腦：10312個來自α-scyn-A53T的細胞和3452個來自WT的細胞），然后進行無監(jiān)督聚類（圖1B）。所得簇顯示出不同的表達模式（圖1C）。所得簇顯示出不同的表達模式（圖1C）。根據報告的標記，我們將簇分配給已知的細胞類型，包括GABA能神經元（MB_GABA、ST_GABA、CB_GABA）、谷氨酸能神經元（MB_GLU、CB_GLU）、5-羥色胺能神經元（MB _SER）、少突膠質細胞（MB_OLG、ST_OLG_1、ST-OLG_2、CB_OLG）、少膠質前體細胞（MB_OPC、ST-OPC、CB_OPC）、星形膠質細胞（MB _AST、ST_AST_1、ST_ATS_2、CB_AST）、小膠質細胞（MB_MG、ST_MG_1、ST_MC_2、CB_MG）、血管細胞（MB_VA）、內皮細胞（ST_END）和周細胞（MB_PEC、ST_PEC、CB_PEC）。我們還確定了區(qū)域特異性細胞類型：中腦多巴胺能神經元（MB_DA）、中棘神經元（ST_MSN_D1、ST_MSN-D2）、膽堿能中間神經元（ST_CHO）、未成熟神經元（ST_IMN）、紋狀體神經祖細胞（ST_NPC）和浦肯野細胞（CB_PC）以及小腦顆粒細胞（CB_GC）（圖1B、1C、S2）。每種細胞類型差異表達的基因的功能富集分析為細胞類型分配提供了進一步的證據（圖1D）。
圖 1
2. snRNA-seq揭示α-syn-A53T中腦轉錄組學異質性
根據α-syn-A53T和WT的不同樣本，將同一簇的細胞分裂（圖2A）。中腦中的所有細胞類型在兩個樣本中都是共享的。盡管如此，人們發(fā)現還有另一個細胞簇，定義為與PD相關的細胞（MB_AP），僅出現在α-syn-A53T中腦（圖2A），不表達任何已知的細胞標志物（圖1C）。據推測，MB_AP是一組受α-syn基因敲入影響的細胞，由中腦內不同類型的細胞組成。由于在敲入基因的影響下，一些相似的細胞進程發(fā)生了變化，細胞表達了相似的特征并聚集在一起。為了確保差異表達基因（DEGs）的統計能力，我們排除了α-syn-A53T或WT中少于三個細胞的細胞類型。在大多數細胞類型中，α-syn-AP3T和WT之間存在大規(guī)模的轉錄改變。在中腦中總共鑒定出2045個上調的DEGs和496個下調的DEGs（圖2B；表S3），細胞類型特異性基因的表達譜如圖2C所示。
圖 2
3. α-syn-A53T紋狀體基因表達的改變
根據α-syn-A53T和WT的兩個不同樣本對紋狀體細胞進行分裂（圖3A），在紋狀體中鑒定出641個上調的DEGs和4608個下調的DEGs（圖3B）。紋狀體中細胞類型特異性基因的表達譜如圖3C所示，其中紋狀體中細胞對選定DEGs的表達是特異的（圖3D）。具體來說，根據D1型（DRD1）和D2型受體（DRD2）的表達，紋狀體MSNs可以進一步分為兩類已知的MSNs。我們鑒定出D1型M-SN和D2型MSNs分別高度表達Drd1、Tac1和Drd2、Penk（表S2）。ST_GABA可以進一步分為已知的亞群，包括Npy+Sst+（C2_SOM-1、C4_SOM-2、C8_SOM-3）、Vip+（C6_Vip）、Pvalb+（C1_Pvalb）、Th+（C7_Th）和Cck+（C5_Cck）（圖3E和3F）。除此之外，我們注意到C0和C3分別高度表達Foxp2和Igfbp4，這可能負責紋狀體中的特定功能（圖3E和3F）。ST_IMN的特征是未成熟神經元標記物的不同表達，如Dcx（圖S2B）。在α-syn-A53T中上調的所有DEGs中，近三分之二在多種細胞類型中上調（圖3G），表明由于突變體Snca的插入，紋狀體中不同細胞類型的基因表達變化具有一定的相似性。
圖 3
4. α-syn-A53T小腦基因表達的改變
在小腦中，根據經典的神經元標記物鑒定出GABA能神經元、谷氨酸能神經元浦肯野細胞、顆粒細胞和神經膠質細胞（圖4A和4B）。特別是在CB_AST中，除了經典的AST標記Slc1a3和Aqp4外，Bergmann膠質細胞還被鑒定為Gdf10的高表達（圖4C和4D）。通過差異基因分析，我們在小腦中鑒定出1636個上調的DEGs和233個下調的DEGs（圖4E和4F；表S3），與紋狀體相比，其中大多數DEGs對單一細胞類型具有特異性（圖4G）。
圖 4
5. 與帕金森病密切相關的細胞類型的鑒定
接下來，我們試圖找到對PD進展有顯著影響的特定細胞類型。為了實現這一目標，使用從DisGeNET檢索的PD風險基因進行了過度代表性分析（Piñero等人，2017）。由于AST已被深入報道通過將α-syn轉移到多巴胺能神經元來促進PD進展，我們接下來檢查了AST的富集水平，發(fā)現PD風險基因在中腦和紋狀體AST群體中富集（包括MB_AST、ST_AST_1、ST_ATS_2），但在小腦中不富集（圖5A）。中腦和紋狀體中的少突膠質細胞譜系（MB_OLG、MB_OPC、S_OLG_1、ST-OLG_2、ST-OPC和CB_OLG）在PD病理中起著模糊的作用，在不同程度上顯示出PD風險基因的強烈富集，這表明可能存在導致PD早期發(fā)生和發(fā)展的未經探索的線索。具體來說，ST_OLG_1的富集度得分為5.23，其次是ST_OPC的4.29，ST_OLG_2的4.01，MB_OLG的3.73，MB_OPC的1.85，CB_OLG的1.34(圖5A）。盡管如此，只有2種小腦細胞類型（CB_GABA、CB_OLG）富集了PD風險基因，這與先前的知識一致，因為小腦直到Braak V期才受到嚴重影響（Poewe等人，2017）。
Fig 5.
參考文獻：
[1] Zhong J , Tang G , Zhu J ,et al.Single cell brain atlas of Parkinson's disease mouse model[J].Journal of Genetics and Genomics, 2021, 48(4).DOI:10.1016/j.jgg.2021.01.003.
