Apogee納米流式儀在眼內(nèi)遞送地塞米松脂質(zhì)體表面特性研究的應(yīng)用

眼部疾病，如年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)、青光眼和糖尿病視網(wǎng)膜病變是視力損害和失明的主要原因。據(jù)預(yù)測，由于人口老齡化，未來20年全球視網(wǎng)膜疾病患者數(shù)量將增加約45%�，F(xiàn)有的抗血管內(nèi)皮生長因子和抗炎藥物通常用于治療后段眼病，但生物屏障嚴重限制了它們的治療效果。因此，為了克服藥物難以接近靶點的問題，大多數(shù)治療視網(wǎng)膜疾病的藥物都是通過玻璃體內(nèi)注射給藥的。雖然小分子可能會滲透到整個視網(wǎng)膜層，它們受到藥物快速清除的影響，因此需要頻繁注射，有極大的感染風(fēng)險。另一方面，大分子和納米藥物的視網(wǎng)膜滲透性較低，因此需要改進給藥方法以獲得治療效果。

意大利科研人員對眼內(nèi)遞送地塞米松的脂質(zhì)體進行表面特性的研究。本研究開發(fā)了具有工程化的表面脂質(zhì)體，以控制其在玻璃體和視網(wǎng)膜中的擴散。該研究中使用Apogee Flow System納米流式分析和評估玻璃體中熒光素標(biāo)記并加載DH（地塞米松）脂質(zhì)體的膠體穩(wěn)定性。氫化大豆磷脂酰膽堿(HSPC)/膽固醇脂體包被合成的非肽細胞滲透增強劑(CPE) (Agm6-M-Oleate) (Agm6-M-Oleate)和/或5%的mPEG2kDa-DSPE。隨著Agm6-M油酸鹽包被濃度的增加，脂質(zhì)體的zeta電位升高，在牛玻璃體中的遷移率和膠體穩(wěn)定性降低。相反，mPEG2kDa- DSPE降低了脂質(zhì)體的zeta電位，恢復(fù)了脂質(zhì)體在玻璃體中的擴散性和穩(wěn)定性。

ApogeeFlow納米流式細胞術(shù)的大角度光散射(LALS)分析評估玻璃體中熒光素標(biāo)記并加載DH的脂質(zhì)體膠體穩(wěn)定性。該儀器可區(qū)分玻璃體大分子和熒光標(biāo)記脂質(zhì)體的信號。圖5A顯示了熒光標(biāo)記的脂質(zhì)體的數(shù)據(jù)，這些脂質(zhì)體在從玻璃體組分信號中去除后圈門。在0天時LALS值不同表明不同細胞穿透增強劑與玻璃體的相互作用不同，特別是5% Agm6-Lipo和mPEG/5% Agm6-Lipo的起始值高于Naked-Lipo和mPEG- lipo，這表明它們在玻璃體中發(fā)生了迅速的粒徑變化。Naked- Lipo和mPEG-Lipo的LALS信號沒有隨著時間的推移而增加，表明這些囊泡的大小在玻璃體中是穩(wěn)定的。相反，5%Agm6-Lipo的LALS信號在20天內(nèi)增加了約50%，表明脂質(zhì)體在玻璃體中逐漸聚集。值得注意的是，通過包被mPEG-DSPE5%后的Agm6-Lipo顯著降低了LALS信號的增加，表明玻璃體中脂質(zhì)體具有顯著的PEG保護作用，這也可以最大限度地減少給藥后對視力的干擾(圖5B)。

Fig.5

Fig.5所示。37℃玻璃體中載DH脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。A.脂質(zhì)體的ApogeeFlow流式圖。B. 脂質(zhì)體在大角度散射光信號與時間的相關(guān)性。

圖7-i中報告的細胞熒光結(jié)果顯示，加載DH的脂質(zhì)體的表現(xiàn)與空白脂質(zhì)體相似;陽離子脂質(zhì)體比中性脂質(zhì)體具有更高的細胞關(guān)聯(lián)性。這證實了藥物裝載不影響囊泡表面，DH不吸附在脂質(zhì)體表面。用共聚焦顯微鏡觀察了加載DH脂質(zhì)體在培養(yǎng)的ARPE19細胞中的內(nèi)化作用。Fig.7-ii A-B顯示，與不含DH的脂質(zhì)體相似，加載DH的Naked-Lipo和mPEG-Lipo不被細胞關(guān)聯(lián)或攝取。相反，5%Agm6-Lipo和mPEG/5%Agm6-Lipo顯示出顯著的細胞關(guān)聯(lián)和對細胞質(zhì)的處置(圖7-ii C-D)。然而，這些配方顯示出不同的細胞結(jié)合和進入模式。5%Agm6在細胞表面或細胞質(zhì)中形成大的聚集體，而mPEG/5%Agm6-lipo進入細胞質(zhì)空間，產(chǎn)生小的熒光點，與不含DH的對應(yīng)物相似。因此，mPEG涂層似乎可以減少陽離子脂質(zhì)體在細胞膜附近的聚集，從而促進細胞攝取。

Fig.7

Fig.7在三種脂質(zhì)體濃度下，加載DH的熒光素- DHPE標(biāo)記脂質(zhì)體孵育ARPE-19細胞的平均熒光強度。數(shù)據(jù)以Mean±S.D. (n = 3)表示。與加載DH的Naked-Lipo進行統(tǒng)計分析。ii) 共聚焦顯微鏡下的ARPE-19細胞與載DH的Naked-Lipo (A)、mPEG- lipo (B)、5%Agm6-Lipo (C)、mPEG/5%Agm6-Lipo (D)共聚焦顯微鏡下的圖像。

所有配方均表現(xiàn)出雙相行為，在前24小時內(nèi)快速釋放，隨后緩釋超過30天。這種行為可以解釋為可以迅速釋放的非絡(luò)合DH和緩慢釋放的與Ca2+絡(luò)合的DH之間的平衡。釋放曲線表明，表面處理后的脂質(zhì)體影響DH的釋放。5%Agm6-Lipo與Naked-Lipo相比，釋放速度更快，這表明插入后的寡位置脂質(zhì)部分可能會影響雙層結(jié)構(gòu)，使其更具滲透性。

Fig.8

Fig.8脂質(zhì)體釋放DH。數(shù)據(jù)以Mean±S.D. (n = 3)表示。
 

結(jié)論：本研究報告的結(jié)果表明，合成的細胞滲透增強劑(CPE)和mPEG的結(jié)合可以成功地用于控制膠體藥物遞送系統(tǒng)在玻璃體內(nèi)表現(xiàn)。我們在這里已經(jīng)證明，Agm6和mPEG在脂質(zhì)體表面的結(jié)合可以實現(xiàn)在玻璃體中的擴散，在玻璃體內(nèi)治療時可以達到視網(wǎng)膜治療的目的。用mPEG包裹Agm6修飾的脂質(zhì)體，在體外和體內(nèi)提供了有效的治療抗炎效果，這是由多種因素共同作用的結(jié)果，包括高效的細胞內(nèi)藥物傳遞和低細胞毒性的載體。另一方面，mPEG和Agm6對脂質(zhì)體/細胞膜的相互作用、內(nèi)吞作用和細胞內(nèi)運輸?shù)恼{(diào)節(jié)機制的影響還需要進一步的研究。

英國Apogee超靈敏納米流式分析儀，專為外泌體微囊泡（EVs）等小顆粒分析優(yōu)化設(shè)計，在EVs樣品顆粒大小分析，絕對定量，多標(biāo)記物同時快速分析工作中廣泛應(yīng)用。截止目前，該設(shè)備已累計參與數(shù)百篇高質(zhì)量同行審議文章相關(guān)實驗分析工作。其出色的靈敏度，穩(wěn)定性及可靠性已備受業(yè)內(nèi)廣泛認可，并將繼續(xù)為EVs相關(guān)基礎(chǔ)研究及轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供堅實支持。

Apogee納米流式除了可用于納米級別的顆粒 （如：細胞外囊泡、外泌體、微生物、病毒顆粒、LNP） 等，還可以用于作常規(guī)動物細胞檢測 （如免疫細胞、哺乳類動物細胞、等）。它是一臺全面且功能強大的納米流式分析儀！

參考文獻：Tailoring surface properties of liposomes for dexamethasoneintraocular administration
M.D. Al-Amin", Francesca Mastrotto", Astrid Subrizi b,e, Merve Send, Tiina TurunencBlanca Arango-Gonzalez ", Marius Ueffing", Alessio Malfanti", Arto Urtti ',c, Stefano Salmaso ",Paolo Caliceti"

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