血液Target-BS揭示靶向DNA甲基化標記水平與患者乳腺癌風險相關
符合遺傳性乳腺癌和卵巢癌（HBOC）標準的患者中，只有不到15-20%攜帶致病性編碼基因突變，意味著可能存在其他分子機制導致這種疾病的風險增加。外周血DNA甲基化是乳腺癌（BC）風險的潛在表觀遺傳標記。在分子水平上，BC 組織中DNA甲基化標記變化主要發(fā)生在致癌發(fā)展的早期階段。但當前的研究主要集中在有限數量的基因和HBOC患者上，并沒有在大規(guī)�；騊anel中分析沒有遺傳致病變異的患者DNA甲基化情況。
2024年6月，墨西哥國立自治大學Iztacala高等研究學院Felipe Vaca-Paniagua團隊通過靶向亞硫酸鹽測序（targeted bisulfite sequencing）對18個腫瘤抑制基因（抑癌基因）啟動子（330個CpG位點）進行甲基化分析。揭示了：① EPCAM（17個CpG位點；p=0.017）和RAD51C（27個CpG位點；p=0.048）中的高甲基化；② BC患者中36個CpG特異性位點的高甲基化（FDR q<0.05）；③ 四個特定CpG位點與更高BC風險相關（FDR q<0.01, Bonferroni p<0.001）：cg89786999-FANCI（OR=1.65；95% CI:1.2–2.2）、cg23652916-PALB2（OR=2.83；95% CI:1.7–4.7）、cg47630224-MSH2（OR=4.17；95% CI:2.1–8.5）和cg47596828-EPCAM（OR=1.84；95% CI:1.5–2.3）。在澳大利亞的一個隊列中對cg47630224-MSH2甲基化進行驗證，顯示BC風險增加3倍（AUC: 0.929；95% CI: 0.904–0.955）。表明四個DNA甲基化CpG位點可能與更高的BC風險相關，可能作為未檢測到編碼突變的患者的生物標志物。相關研究成果以“Methylation marks in blood DNA reveal breast cancer risk in patients fulfilling hereditary disease criteria”發(fā)表在《npj Precision Oncology》（IF 6.8）期刊上。
研究方法：
（1）實驗設計
圖1：實驗設計
a. 患者選擇的招募和入選標準
b. Target-BS樣本準備、亞硫酸鹽處理、靶向啟動子和總擴增分析
c. DNA文庫制備workflow、條形碼、自動化生物信息學分析和生物統(tǒng)計分析
（2）高通量DNA甲基化測序揭示高風險乳腺癌患者抑癌基因中的異常甲基化。
a.分析抑癌基因（TSGs）啟動子區(qū)域的位點特異性甲基化狀態(tài)。
b. EPCAM、ATM、RAD51C和POLH中高甲基化CpG位點的差異水平。TSS表示轉錄起始位點，CGI表示CpG島相對位點，PC表示陽性對照，TSGs代表抑癌基因。
（3）乳腺癌患者在四個特定CpG位點表現出高甲基化富集
b. 330個特異性CpG位點的PCA分析。cg8978699-FANCI、cg23652916-PALB2、cg47630224-MSH2和cg47596828-EPCAM的差異最大（箭頭所示）。所有EPCAM位點形成了一個獨立的組。
c. 各個CpG位點的差異高甲基化水平。紅點代表顯著位點。
d. 與對照組相比，顯著CpG位點的差異高甲基化。
圖4：比較患者組與對照組中PALB2、EPCAM、MSH2和FANCI啟動子區(qū)域的位點特異性種系甲基化水平。
a-d. 顯示四個基因位點。藍色實線表示來自血液對照的平均甲基化值。橙色虛線表示患者平均甲基化值。位點cg47596828-EPCAM、cg47630224-MSH2、cg23652916-PALB2和cg89786999-FANCI在患者中顯示出統(tǒng)計學上顯著的甲基化水平增加�；騾^(qū)域的示意圖表示CpG島和轉錄起始位點（TSS）。
b. cg23652916-PALB2和cg47630224-MSH2的Z分數共甲基化水平。
（4）四個特異性高甲基化CpG位點作為乳腺癌風險的潛在生物標志物
b. 四個CpG位點的ROC性能。
c. 對11個CpG位點組合的靈敏度和特異性進行綜合分析。黃色氣泡代表最佳標記組合（Se>70%，Sp>60%），稱為“金標準標記”。
d. 金標準標記組合7、10和11的生物標志物能力。
e. 在三個國際隊列中對cg47630224-MSH2進行差異甲基化分析。
f. cg47630224-MSH2位點與三個隊列中BC風險的關聯分析。
g. 所有隊列中cg47630224-MSH2位點的生物標志物能力：澳大利亞（藍色）、烏拉圭（綠色）、意大利（紅色）。
易小結
本研究在單個堿基分辨率下對大型病例對照數據集中的高風險基因啟動子區(qū)域進行全面分析，利用健康人群對照來最小化非遺傳和環(huán)境因素引起的甲基化水平變異。提供了關于符合HBOC標準的乳腺癌患者種系甲基化與癌癥易感性基因之間的相關性證據（這些患者沒有可檢測到的編碼致病變異）。研究共鑒定出四個新的潛在表觀遺傳標記，與更高的乳腺癌風險相關，這些標記在獨立隊列中得到了驗證�？傮w而言，這項工作有助于提高對高風險乳腺癌患者的表觀遺傳譜的理解，這可能是病因學的其他機制。進一步研究表觀遺傳標記有潛力增強風險評估，并促進乳腺癌管理中的個性化方法。
圖7：與乳腺癌風險相關的異常甲基化標記模型。
參考文獻：
Ruiz-De La Cruz M,et al. Methylation marks in blood DNA reveal breast cancer risk in patients fulfilling hereditary disease criteria. NPJ Precis Oncol. 2024 Jun 19;8(1):136. pii: 10.1038/s41698-024-00611-z. doi: 10.1038/s41698-024-00611-z. PubMed PMID: 38898118.
2024年6月，墨西哥國立自治大學Iztacala高等研究學院Felipe Vaca-Paniagua團隊通過靶向亞硫酸鹽測序（targeted bisulfite sequencing）對18個腫瘤抑制基因（抑癌基因）啟動子（330個CpG位點）進行甲基化分析。揭示了：① EPCAM（17個CpG位點；p=0.017）和RAD51C（27個CpG位點；p=0.048）中的高甲基化；② BC患者中36個CpG特異性位點的高甲基化（FDR q<0.05）；③ 四個特定CpG位點與更高BC風險相關（FDR q<0.01, Bonferroni p<0.001）：cg89786999-FANCI（OR=1.65；95% CI:1.2–2.2）、cg23652916-PALB2（OR=2.83；95% CI:1.7–4.7）、cg47630224-MSH2（OR=4.17；95% CI:2.1–8.5）和cg47596828-EPCAM（OR=1.84；95% CI:1.5–2.3）。在澳大利亞的一個隊列中對cg47630224-MSH2甲基化進行驗證，顯示BC風險增加3倍（AUC: 0.929；95% CI: 0.904–0.955）。表明四個DNA甲基化CpG位點可能與更高的BC風險相關，可能作為未檢測到編碼突變的患者的生物標志物。相關研究成果以“Methylation marks in blood DNA reveal breast cancer risk in patients fulfilling hereditary disease criteria”發(fā)表在《npj Precision Oncology》（IF 6.8）期刊上。
研究方法：
- 研究對象包括231名符合HBOC標準的乳腺癌患者（這些患者未檢測到編碼致病變異）和156名健康對照組。
- 通過靶向亞硫酸鹽測序（targeted bisulfite sequencing，Target-BS）對18個腫瘤抑制基因啟動子區(qū)域（330個CpG位點）進行甲基化分析。
- 使用統(tǒng)計和生物信息學方法分析甲基化數據，包括Wilcoxon秩和檢驗、多元邏輯回歸分析、ROC曲線分析等。
- 獨立隊列驗證。
（1）實驗設計
圖1：實驗設計
b. Target-BS樣本準備、亞硫酸鹽處理、靶向啟動子和總擴增分析
c. DNA文庫制備workflow、條形碼、自動化生物信息學分析和生物統(tǒng)計分析
（2）高通量DNA甲基化測序揭示高風險乳腺癌患者抑癌基因中的異常甲基化。
圖2：乳腺癌抑癌基因啟動子區(qū)域的高甲基化CpG位點。
a.分析抑癌基因（TSGs）啟動子區(qū)域的位點特異性甲基化狀態(tài)。
b. EPCAM、ATM、RAD51C和POLH中高甲基化CpG位點的差異水平。TSS表示轉錄起始位點，CGI表示CpG島相對位點，PC表示陽性對照，TSGs代表抑癌基因。
（3）乳腺癌患者在四個特定CpG位點表現出高甲基化富集
圖3：四種異常DNA甲基化標記與乳腺癌相關。
a. 每個啟動子的平均Z分數的主成分分析（PCA）。b. 330個特異性CpG位點的PCA分析。cg8978699-FANCI、cg23652916-PALB2、cg47630224-MSH2和cg47596828-EPCAM的差異最大（箭頭所示）。所有EPCAM位點形成了一個獨立的組。
c. 各個CpG位點的差異高甲基化水平。紅點代表顯著位點。
d. 與對照組相比，顯著CpG位點的差異高甲基化。
圖4：比較患者組與對照組中PALB2、EPCAM、MSH2和FANCI啟動子區(qū)域的位點特異性種系甲基化水平。
圖5：cg23652916-PALB2和cg47630224-MSH2位點的共甲基化。
a. 監(jiān)督分層聚類熱圖顯示51名患者中MSH2-PALB2共甲基化亞群。Y軸：CpG位點。X軸：對照組和患者。下方的條形顯示每個患者與每個高甲基化位點相關的年齡、組織病理學和分子亞型。DCIS代表導管原位癌，LCIS代表小葉原位癌，IDC代表浸潤性導管癌，ILC代表浸潤性小葉癌，MC代表髓樣癌，PC代表陽性對照。b. cg23652916-PALB2和cg47630224-MSH2的Z分數共甲基化水平。
（4）四個特異性高甲基化CpG位點作為乳腺癌風險的潛在生物標志物
圖6：獨立驗證隊列中四個CpG位點的生物標志物潛力以及 cg47630224-MSH2 與乳腺癌風險之間的關聯。
a. 四個高甲基化CpG位點的乳腺癌風險。b. 四個CpG位點的ROC性能。
c. 對11個CpG位點組合的靈敏度和特異性進行綜合分析。黃色氣泡代表最佳標記組合（Se>70%，Sp>60%），稱為“金標準標記”。
d. 金標準標記組合7、10和11的生物標志物能力。
e. 在三個國際隊列中對cg47630224-MSH2進行差異甲基化分析。
f. cg47630224-MSH2位點與三個隊列中BC風險的關聯分析。
g. 所有隊列中cg47630224-MSH2位點的生物標志物能力：澳大利亞（藍色）、烏拉圭（綠色）、意大利（紅色）。
易小結
本研究在單個堿基分辨率下對大型病例對照數據集中的高風險基因啟動子區(qū)域進行全面分析，利用健康人群對照來最小化非遺傳和環(huán)境因素引起的甲基化水平變異。提供了關于符合HBOC標準的乳腺癌患者種系甲基化與癌癥易感性基因之間的相關性證據（這些患者沒有可檢測到的編碼致病變異）。研究共鑒定出四個新的潛在表觀遺傳標記，與更高的乳腺癌風險相關，這些標記在獨立隊列中得到了驗證�？傮w而言，這項工作有助于提高對高風險乳腺癌患者的表觀遺傳譜的理解，這可能是病因學的其他機制。進一步研究表觀遺傳標記有潛力增強風險評估，并促進乳腺癌管理中的個性化方法。
圖7：與乳腺癌風險相關的異常甲基化標記模型。
參考文獻：
Ruiz-De La Cruz M,et al. Methylation marks in blood DNA reveal breast cancer risk in patients fulfilling hereditary disease criteria. NPJ Precis Oncol. 2024 Jun 19;8(1):136. pii: 10.1038/s41698-024-00611-z. doi: 10.1038/s41698-024-00611-z. PubMed PMID: 38898118.
標簽：
DNA甲基化
