低溫條件下的超分辨率LIGHTNING技術(shù)和TauSense技術(shù)

LIGHTNING和TauSense

如何提高聚焦離子束(FIB)加工的定位精度

LIGHTNING超分辨率檢測和TauSense技術(shù)能夠獲得更好的低溫?zé)晒獬上�，促進(jìn)了低溫光電聯(lián)用工作流程。

熒光顯微鏡圖像能夠?yàn)閏ryo-FIB加工提供定位支持，其質(zhì)量決定了所制備薄片的結(jié)果。本文描述了LIGHTNING技術(shù)是如何顯著提高圖像質(zhì)量，以及如何利用該技術(shù)基于熒光壽命的信息來辨別樣品的不同結(jié)構(gòu)。

 

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學(xué)習(xí)要點(diǎn)

低溫條件下的超分辨率LIGHTNING技術(shù)

• 該技術(shù)是如何工作的？

• 反卷積是一種較為普遍的技術(shù)，那LIGHTNING有什么特別的地方？

• 使用STELLARIS Cryo共聚焦顯微鏡時(shí)，LIGHTNING技術(shù)如何提高樣品定位精度？

• 使用LIGHTNING技術(shù)反卷積后，我可以量化數(shù)據(jù)嗎？

 

低溫條件下的TauSense技術(shù)

• 什么是TauSense技術(shù)？

• TauSense技術(shù)如何工作?

• TauContrast

• TauScan

• TauSeparation

• TauGating

• 將TauSense技術(shù)完全集成到Coral Cryo軟件的工作流程中

 

介 紹

冷凍電子斷層掃描技術(shù)(Cryo-ET)是一種透射電子顯微鏡(TEM)技術(shù)，該技術(shù)通過分析一系列傾轉(zhuǎn)圖像，對相對較薄體積的樣品（約200-300 nm厚）進(jìn)行成像。通過該技術(shù)，可以揭示蛋白質(zhì)的3D分子結(jié)構(gòu)。

隨著近十年來， cryo-FIB和cryo-TEM的樣品制備技術(shù)飛速發(fā)展，已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)部的天然環(huán)境中，使用cryo-ET技術(shù)解析蛋白質(zhì)和其他生物分子的結(jié)構(gòu)，分辨率可達(dá)到亞納米級。使用這種方法，細(xì)胞需要生長在TEM載網(wǎng)上，再通過投入冷凍將樣品玻璃化，然后轉(zhuǎn)移至冷凍-FIB/SEM加工出小窗口（薄片）。隨后就可以使用cryo-TEM對薄片成像，獲得一系列傾轉(zhuǎn)圖像。細(xì)胞的成像窗口必須足夠薄，以便允許電子束穿透樣品。

然而，為了確定樣本中的特定點(diǎn)，需要對感興趣區(qū)域進(jìn)行高精度地定位。目前，這主要是通過冷凍共聚焦熒光顯微鏡進(jìn)行3D高精度成像實(shí)現(xiàn)的。共聚焦針孔能夠消除了離焦光線，特別是在軸向方向，從而提高分辨率和對比度。

在下文中，解釋了如何在低溫條件下使用LIGHTNING超分辨技術(shù)和TauSense基于熒光壽命的工具，使用熒光顯微鏡更好地辨別和識別目標(biāo)結(jié)構(gòu)，以便用于后續(xù)的電鏡工作流程。

 

低溫條件下的超分辨LIGHTNING技術(shù)

該技術(shù)是如何工作的？

盡管共聚焦顯微鏡提供了極好的3D掃描成像質(zhì)量，但在成像過程中仍然會(huì)發(fā)生衍射現(xiàn)象，從而限制成像的分辨率。該現(xiàn)象是每個(gè)成像系統(tǒng)設(shè)置的特征，可以描述為所謂的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(PSF)。該方法得到的圖像是樣本與成像系統(tǒng)的PSF和設(shè)定條件的卷積（折疊）。衍射現(xiàn)象會(huì)產(chǎn)生較為模糊的圖像，導(dǎo)致有效分辨率降低和每一個(gè)光子定位偏差。同時(shí)，樣品圖像還存在其他干擾信號，如背景和噪聲，影響從原始數(shù)據(jù)中獲得的信息。

然而，現(xiàn)在可以通過精密的模型，從樣品的離焦區(qū)域識別單個(gè)光子的干擾信號，然后通過與其原始位置的相關(guān)性對其進(jìn)行反卷積。通過這種方法可以獲得超分辨率圖像。

反卷積是一種較為普遍的技術(shù)眾所周知的，但什么是特別的那LIGHTNING有什么特別的地方？

共聚焦顯微鏡的傳統(tǒng)反卷積方法，通常使用一個(gè)全局設(shè)置進(jìn)行圖像重建，該過程不考慮圖像中的不均勻性。因此，攜帶信息的信號可能被拒絕，而不需要的信號（如背景或噪聲）可能被錯(cuò)誤地解釋為信息。

另一方面，LIGHTNING技術(shù)包括位置依賴、精確體素的差異。這種自適應(yīng)過程能夠全自動(dòng)、準(zhǔn)確地恢復(fù)任何生物樣本的信息，即使在低溫條件下的成像結(jié)果（圖1）。

圖1：傳統(tǒng)反卷積和LIGHTNING技術(shù)之間的差異。LIGHTNING技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)算法使用一個(gè)全局設(shè)置，確定單個(gè)體素精確的信號-背景值，以適應(yīng)每個(gè)單個(gè)像素，并允許自動(dòng)批處理。

通過去除不需要的背景信號和噪聲，LIGHTNING技術(shù)能夠提高圖像質(zhì)量。在實(shí)際反卷積之前的預(yù)處理步驟中，需要確定全局背景值。根據(jù)實(shí)際局部信號和噪聲之間的比值，將全局背景微調(diào)至局部背景值中。噪聲可以根據(jù)其高空間頻率進(jìn)行識別，通過忽略噪聲可以更好地獲得攜帶有信息的信號。

圖2：不應(yīng)用（上排）和應(yīng)用LIGHTNING技術(shù)（下排）的共焦Z-堆棧的投影。左圖：感興趣區(qū)域1和感興趣區(qū)域2的概覽圖，參見中心和左側(cè)圖。中間圖：區(qū)域1的放大圖，信號強(qiáng)度如圖所示，不應(yīng)用和應(yīng)用LIGHTNING技術(shù)。應(yīng)用LIGHTNING技術(shù)后，脂滴信號的半高全寬改善，噪聲和背景被清除。左側(cè)圖：管狀結(jié)構(gòu)在應(yīng)用LIGHTNING技術(shù)后清晰可見，信號強(qiáng)度如圖所示。Sum159細(xì)胞，乳腺癌細(xì)胞由德國海德堡歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室（EMBL）Mahamid Group的Ievgeniia Zagoriy提供。藍(lán)色- Hoechst -細(xì)胞核，綠色- MitoTracker Green-線粒體，紅色- Bodipy -脂質(zhì)滴。比例尺為5 µm，區(qū)域1的線條長度為1.6 µm，區(qū)域2的線條長度為1.5 µm。

圖2為使用標(biāo)準(zhǔn)共聚焦顯微鏡（上圖）和LIGHTNING超分辨共聚焦（下圖）拍攝的兩個(gè)代表性的癌細(xì)胞圖像，其中顯示了線粒體（綠色）、脂滴（紅色）和細(xì)胞核（藍(lán)色）。從對比結(jié)果中可以清楚地看到，LIGHTNING技術(shù)能夠去除背景和噪聲，獲得對比度較高的圖像，更容易識別和辨別目標(biāo)結(jié)構(gòu)。圖像質(zhì)量的明顯改善，使得識別后續(xù)相關(guān)步驟所需的目標(biāo)結(jié)構(gòu)變得更為容易。

當(dāng)在高倍鏡下成像時(shí)，LIGHTNING技術(shù)的影響更加明顯，如圖2所示的放大區(qū)域。

如區(qū)域1中的脂滴圖像所示，通過LIGHTNING技術(shù)能夠降低背景和噪聲，從而改善信號，更精確地定向觀察脂滴結(jié)構(gòu)。

在區(qū)域2中所觀察到的管狀結(jié)構(gòu)也得到相同的結(jié)果。LIGHTNING技術(shù)提高了線粒體膜的對比度，使管狀外觀更加清晰，不僅提高了定位效率，而且增強(qiáng)了CLEM光電關(guān)聯(lián)過程的精確度。

 

使用LIGHTNING技術(shù)反卷積后，我可以量化我的數(shù)據(jù)嗎？

答案是肯定的。生成決策掩碼的過程基于通用圖像處理方法，因此是完全可量化的。整個(gè)流程中，沒有改變單個(gè)光子的強(qiáng)度或定位特征，以及光子計(jì)數(shù)信息。該流程僅從現(xiàn)有共聚焦數(shù)據(jù)中提取信息，不做任何修改。

無論是否使用自適應(yīng)方法，在重建過程中沒有局部和相對強(qiáng)度失真。通過使用自適應(yīng)的、基于決策掩模的方法，將產(chǎn)生偽影或丟失信息的概率降至最低。

圖3：共聚焦Z-堆棧的投影。Sum159細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞由德國海德堡歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室（EMBL）Mahamid Group的Ievgeniia Zagoriy提供。藍(lán)色- Hoechst -表示細(xì)胞核，綠色- MitoTracker Green-線粒體，紅色- Bodipy -脂質(zhì)滴。

 

低溫條件下的TauSense技術(shù)

什么是TauSense技術(shù)？

TauSense 技術(shù)是一個(gè)利用基于熒光壽命的信息的工具集。因此，它為理解細(xì)胞功能提供了額外的信息。此外，TauSense技術(shù)可以提高圖像質(zhì)量，并擴(kuò)展區(qū)分給定標(biāo)本中熒光基團(tuán)的能力。TauSense技術(shù)可在應(yīng)用與室溫樣品和冷凍玻璃化樣品。

 

TauSense技術(shù)如何工作?

熒光產(chǎn)生過程中存在一個(gè)內(nèi)在現(xiàn)象，即熒光基團(tuán)的激發(fā)與其光子發(fā)射之間具有特定時(shí)間間隔。因此，就可以利用脈沖激光激發(fā)樣品中的熒光基團(tuán)，測量探測器處的光子到達(dá)的時(shí)間（圖4）。

圖4：TauSense技術(shù)：脈沖激光激發(fā)熒光基團(tuán)，并確定激光脈沖與光子到達(dá)探測器之間的時(shí)間。時(shí)間間隔被稱為tau或熒光壽命。使用TauSense技術(shù)，確定平均到達(dá)時(shí)間(AAT)。

上述時(shí)間間隔被稱為熒光壽命。熒光壽命取決于熒光基團(tuán)種類及其微環(huán)境。將兩個(gè)（或多個(gè)）熒光源的貢獻(xiàn)進(jìn)行分開的能力，使TauSense技術(shù)成為生命科學(xué)的強(qiáng)大分析工具。使用TauSense技術(shù)，能夠確定光子的到達(dá)時(shí)間，并開發(fā)為一個(gè)額外的維度，允許觀察微環(huán)境變化和多通道熒光基團(tuán)。

 

TauContrast

TauSense計(jì)算每個(gè)獨(dú)立像素的平均到達(dá)時(shí)間(AAT)，并通過標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)度圖像之外的不同顏色將其顯示為另一個(gè)維度。TauContrast具有特定的熒光壽命強(qiáng)度圖（LUT；圖5）。

圖5：用TauContrast技術(shù)研究硅藻。標(biāo)準(zhǔn)共聚焦圖像：樣品的熒光強(qiáng)度圖像。TauContrast技術(shù): 熒光壽命強(qiáng)度圖表示光子平均到達(dá)時(shí)間。較短的到達(dá)時(shí)間為藍(lán)色，較長的為黃色至紅色。TauContrast技術(shù)所得結(jié)果顯示了不同的結(jié)構(gòu)，可以區(qū)分出兩個(gè)終生組分：組分1為葉綠體的自發(fā)熒光，< 1 ns，組分2在平均到達(dá)時(shí)間約2.7 ns處為LifeAct-GFP信號。

樣本由德國TU Dresden，B CUBE的Nicole Poulsen提供。

藍(lán)色范圍顯示較短的AATs，紅色顯示較長的值。因此，可以從圖像中立即直觀地區(qū)分不同的AATs。通常，反射和某些類型的自發(fā)熒光在1 ns以下用“較短”的AATs表示，而熒光蛋白產(chǎn)生的靶信號的AATS則在1 ns以上的“較長”范圍內(nèi)。該結(jié)果能夠辨別、分離和去除圖像中干擾隨后光電關(guān)聯(lián)流程的信號。

 

TauScan

可以使用熒光壽命分布來識別和區(qū)分不同熒光壽命的組分，例如樣品中的不同熒光標(biāo)記。利用TauScan，可以將這些分布掃描并分離成預(yù)定數(shù)量的時(shí)間窗（圖6）。

數(shù)字預(yù)設(shè)門后進(jìn)行多指數(shù)分量擬合，生成每一個(gè)組分到達(dá)時(shí)間分布的線視圖（圖6，底部）。這種分布使人們能夠以類似于熒光信號光譜分布的方式處理到達(dá)時(shí)間信息。

該方法能夠獲得信號的時(shí)間離散信息，然后根據(jù)光子通量中包含的到達(dá)時(shí)間信息，設(shè)定適當(dāng)?shù)臅r(shí)間窗口分割光子信號。在區(qū)分信號后，根據(jù)光子的空間編碼可獲得相應(yīng)的圖像。TauScan實(shí)驗(yàn)獲得的圖像是包含熒光壽命分布中時(shí)間離散信息（上文解釋的時(shí)間窗口）的強(qiáng)度圖像。

圖6：用TauScan觀察硅藻，獲得樣品的標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)度圖像。使用TauScan技術(shù)，可以檢測到代表2個(gè)熒光組分的2個(gè)AAT最大值。這里，選擇了10個(gè)壽命范圍，得到10組壽命圖像。樣本由德國TU Dresden，B CUBE的Nicole Poulsen提供。

 

TauSeparation

TauSeparation技術(shù)使用組分的熒光壽命分布，如TauScan所得的分布數(shù)據(jù)，以此分離樣品中的熒光物質(zhì)。用戶借助在線圖表決定最具代表性的平均壽命組分的值。然后TauSeparation選擇合適的時(shí)間窗口，在單獨(dú)的圖像中顯示該組分（圖7）。這樣，即使是不能通過其光譜性質(zhì)區(qū)分的熒光基團(tuán)，也可以通過不同的熒光壽命強(qiáng)度圖顏色進(jìn)行分離和直觀的辨別。因此，該方法可以有效區(qū)分電子顯微鏡的目標(biāo)結(jié)構(gòu)，增加光電關(guān)聯(lián)工作流程的可靠性。

圖7：用TauSeparation觀察硅藻。樣品的標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)度圖像。通過應(yīng)用TauScan技術(shù)識別2個(gè)組分，結(jié)果顯示可以通過分配不同的顏色來分離圖像中的組分。這些組分分別與葉綠體（藍(lán)綠色）和LifeAct-GFP（品紅色）有關(guān)。樣本由德國TU Dresden，B CUBE的Nicole Poulsen提供。

 

TauGating

除了分離組分，人們還可以去除特定的時(shí)間范圍內(nèi)顯示的信息，這樣就可以進(jìn)一步區(qū)分目標(biāo)信號和非貢獻(xiàn)信號（圖8）。

對于電子顯微鏡工作流程而言，特別是應(yīng)用與載網(wǎng)上的低溫電鏡技術(shù)，有時(shí)可以觀察到碳層或樣品支撐層的自發(fā)熒光和反射信號。將TauGating技術(shù)應(yīng)用于相關(guān)通道可清除目標(biāo)熒光信號，因此增加了下游工藝（如FIB切割）定位精度。

圖8：去除來自碳層的干擾背景信號。萊茵衣藻中兩種不同類型的鞭毛內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，IFT-NeonGreen和IFT-mCherry。樣品由德國德累斯頓馬克斯·普朗克分子細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)研究所的Pigino-Lab提供。

 

完全集成到Coral Cryo軟件工作流程中

LIGHTNING和TauSense這兩種模式都被完全集成到Coral Cryo 工作流程中（圖9）。

圖9：LIGHTNING技術(shù)完全嵌入到Coral Cryo軟件工作流程中。LIGHTNING技術(shù)可應(yīng)用于每個(gè)薄片區(qū)域掃描工作中。因此，該方法可以展示出低溫條件下Cryo CLEM物鏡的完全分辨能力。

對于LIGHTNING技術(shù)而言，軟件提供了一個(gè)向?qū)Я鞒?/span>，指導(dǎo)用戶如何根據(jù)需要定義合適的設(shè)置（例如，更高的采集速度與更高分辨率）。這些相互關(guān)聯(lián)的參數(shù)會(huì)被自動(dòng)設(shè)定，以得到預(yù)期的高質(zhì)量圖像。

所有TauSense工具都直觀地嵌入到探測器設(shè)置中，可以通過雙擊鼠標(biāo)激活（圖9）。

圖10：TauSense完全嵌入到Coral Cryo軟件工作流程中。所有TauSense工具在探測器設(shè)置中均可訪問。

總 結(jié)

LIGHTNING和TauSense技術(shù)是幫助用戶提高圖像質(zhì)量和改善圖像數(shù)據(jù)信息內(nèi)容的工具。LIGHTNING技術(shù)增強(qiáng)了在低溫條件下獲得圖像的分辨率，TauSense技術(shù)幫助用戶將目標(biāo)熒光信號與其他熒光基團(tuán)甚至不需要的熒光基團(tuán)（如自發(fā)熒光和/或反射）的信號區(qū)分開。這兩種工具都使用戶能夠進(jìn)行低溫工作流程，以更可靠和準(zhǔn)確地識別冷凍玻璃化樣品內(nèi)的目標(biāo)結(jié)構(gòu)，特別是對于低溫電子斷層掃描樣品。

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