加拿大科研人員制定細(xì)胞外囊泡不同分離技術(shù)和表征方法入門詳解

外泌體是一種直徑為20 - 150nm的膜結(jié)合生物納米囊泡，主要由內(nèi)吞膜產(chǎn)生，并通過胞吐作用釋放。它們?cè)?0世紀(jì)80年代初被首次發(fā)現(xiàn)，是網(wǎng)狀細(xì)胞釋放的含有轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)的小膜泡，并被證明以旁分泌或內(nèi)分泌方式調(diào)節(jié)生物過程，并運(yùn)輸各種物質(zhì)，包括信使RNA (mRNA)、microRNA (miRNA)、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)。正因?yàn)槿绱�，外泌體在治療和診斷領(lǐng)域引起了人們的關(guān)注，包括它們作為納米載體將藥物/分子物質(zhì)運(yùn)輸?shù)桨悬c(diǎn)、治療應(yīng)用和作為生物標(biāo)志物。

加拿大西安大略大學(xué)的科研人員通過不同分離技術(shù)和表征細(xì)胞外囊泡的方法制定了基礎(chǔ)的入門方案。在本研究中通過使用四種分離方法來獲取細(xì)胞外囊泡，并且使用Apogee納米流式儀對(duì)分離后的細(xì)胞外囊泡進(jìn)行表征。包括:(i) 補(bǔ)充聚乙二醇和氯化鈉條件培養(yǎng)基后進(jìn)行低速離心;(iii)通過100 kda排除過濾器過濾條件介質(zhì);(iv)使用標(biāo)準(zhǔn)商用試劑盒進(jìn)行分離。然后在分離外泌體之前，將該培養(yǎng)基中的細(xì)胞和碎片去除，通過0.2 mm過濾器過濾，并補(bǔ)充蛋白酶和RNAse抑制劑。純化后的EVs可立即使用，或在4℃下穩(wěn)定保存(長(zhǎng)達(dá)一周用于成像或下游EVs實(shí)驗(yàn))，或在- 80℃下長(zhǎng)時(shí)間保存，然后用于生化研究。本研究的目的不是比較這些方法，而是向有需要的人提供所描述方法，以便研究人員可以在各自的條件下選擇 “最佳方法”分離細(xì)胞外囊泡。

富集培養(yǎng)基（ECM）中加入50%聚乙二醇(PEG) 8000溶液(在ddH2O中)至終濃度為10% PEG，通過倒置混合均勻，加入NaCl至終濃度為75 mM，再通過倒置混合。然后將混合物在4℃下孵育4 - 16小時(shí)。與極短的孵育時(shí)間相比，較長(zhǎng)的孵育時(shí)間可能會(huì)增加外泌體的產(chǎn)量。然后將樣品在16000g下在4℃下離心1小時(shí)，沉淀外泌體部分。然后將顆粒重懸在1xPBS中。為了去除顆粒中任何殘留的污染物，再次重復(fù)此過程。最終的外泌體富集部分保存在1xPBS中，4℃短期保存(天)，- 20℃長(zhǎng)期保存(月)，最好在- 80℃保存，但在后一種情況下，應(yīng)謹(jǐn)慎使用低蛋白結(jié)合管。(a)PEG 8000增加了EV的沉降系數(shù)，因此可以通過低速離心分離EVs。(b)散點(diǎn)圖的流式細(xì)胞術(shù)顯示HEK293或SH-SY5Y細(xì)胞在血清耗盡(Exo -耗盡血清)或無(wú)血清的DMEM中培養(yǎng)基的所分泌的外泌體數(shù)量（PE標(biāo)記的CD9抗體陽(yáng)性EV）。

圖2。基于PEG8000的EV分離。
 

富集培養(yǎng)基（ECM）在4℃下以10萬(wàn)g離心75-90分鐘，使用適合超離心的離心管使EV聚集成沉淀。采用針穿刺技術(shù)，從管中抽出上清，在底部留下外泌體富集沉淀;將EV重懸于100 mL含蛋白酶抑制劑和RNAseOUT的冰PBS中 。(a)EV在4℃下超速離心以100,000g的75分鐘，分離EVs。(b)散點(diǎn)圖的流式細(xì)胞術(shù)顯示HEK293或SH-SY5Y細(xì)胞在血清耗盡(Exo -耗盡血清)或無(wú)血清的DMEM中培養(yǎng)基的所分泌的外泌體數(shù)量（PE標(biāo)記的CD9抗體陽(yáng)性EV）。

圖3�；�于超離心的EV的分離。 

不同的過濾裝置可能具有不同程度的蛋白質(zhì)結(jié)合親和力和EV的截留能力。推薦使用低蛋白結(jié)合親和力的過濾器，如ThermoFisher PierceTM protein Concentrator PES, 100K MWCO。在這個(gè)過程中，含有外泌體富集部分會(huì)截留在過濾器上。(a)示意圖。分泌組的內(nèi)容物通過100 kda的過濾膜后，膜上部的上清含有外泌體富集組分。(b)散點(diǎn)圖的流式細(xì)胞術(shù)顯示HEK293或SH-SY5Y細(xì)胞在血清耗盡(Exo -耗盡血清)或無(wú)血清的DMEM中培養(yǎng)基的所分泌的外泌體數(shù)量（PE標(biāo)記的CD9抗體陽(yáng)性EV）。

圖4�；�于超濾的EVs分離。
 

根據(jù)下游技術(shù)和所需的外泌體純度，外泌體可以被分離出來或進(jìn)一步純化(通過超離心、蔗糖密度梯度離心或尺寸排阻)。(a)外泌體的內(nèi)含物通過100 kda的過濾膜，然后通過在4℃下以100,000g離心75分鐘，從膜的頂端得到的上清用于進(jìn)一步純化。(b)散點(diǎn)圖的流式細(xì)胞術(shù)顯示HEK293或SH-SY5Y細(xì)胞在血清耗盡(Exo -耗盡血清)或無(wú)血清的DMEM中培養(yǎng)基的所分泌的外泌體數(shù)量（PE標(biāo)記的CD9抗體陽(yáng)性EV）。

圖5�；�于超濾-超離心的EV分離

有幾種商業(yè)試劑盒用于從不同的生物樣品或細(xì)胞培養(yǎng)條件培養(yǎng)基中分離和純化外泌體。這些試劑盒通常是基于聚合物沉淀與SEC或過濾相結(jié)合。雖然使用試劑盒可以快速提供純外泌體，但產(chǎn)量可能低于“金標(biāo)準(zhǔn)”方法（如超速離心法），并且相關(guān)的成本可能使一些實(shí)驗(yàn)室望而卻步。在這里，我們使用了一個(gè)商業(yè)套件（Exo- spinTM mini (Cell Guidance Systems LLC, USA)，它同時(shí)依賴于沉淀和SEC。（a）基于Exo-spinTM迷你試劑盒的外泌體分離試劑盒示意圖。外泌體溶解于試劑盒緩沖液中，離心沉淀，重懸于PBS中，然后應(yīng)用于SEC進(jìn)行進(jìn)一步純化。(b)散點(diǎn)圖的流式細(xì)胞術(shù)顯示HEK293或SH-SY5Y細(xì)胞在血清耗盡(Exo -耗盡血清)或無(wú)血清的DMEM中培養(yǎng)基的所分泌的外泌體數(shù)量（PE標(biāo)記的CD9抗體陽(yáng)性EV）。

圖6�；�于試劑盒的外泌體提取。

結(jié)論

近年來外泌體治療和診斷的應(yīng)用呈指數(shù)增長(zhǎng)。隨著我們繼續(xù)了解它們的生物發(fā)生和功能，分離和表征外泌體的試劑、技術(shù)和方案的不斷發(fā)展也變得至關(guān)重要。這些進(jìn)步強(qiáng)調(diào)了建立完善和標(biāo)準(zhǔn)化方法的必要性，并導(dǎo)致了增強(qiáng)外泌體分離和表征的協(xié)議。這些方法的不斷優(yōu)化已經(jīng)使外泌體從復(fù)雜的生物液體(如血液、尿液和組織培養(yǎng)基)中純化出來，使它們成為轉(zhuǎn)化研究的寶貴資源。然而，由于不存在單一的最佳分離技術(shù)，因此每個(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)研究目的、下游應(yīng)用以及可用的資源/設(shè)備來選擇合適的方法。

Summary

英國(guó)Apogee超靈敏納米流式分析儀，專為外泌體微囊泡（EVs）等小顆粒分析優(yōu)化設(shè)計(jì)，在EVs樣品顆粒大小分析，絕對(duì)定量，多標(biāo)記物同時(shí)快速分析工作中廣泛應(yīng)用。截止目前，該設(shè)備已累計(jì)參與數(shù)百篇高質(zhì)量同行審議文章相關(guān)實(shí)驗(yàn)分析工作。其出色的靈敏度，穩(wěn)定性及可靠性已備受業(yè)內(nèi)廣泛認(rèn)可，并將繼續(xù)為EVs相關(guān)基礎(chǔ)研究及轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)支持。

Apogee納米流式除了可用于納米級(jí)別的顆粒 （如：細(xì)胞外囊泡、外泌體、微生物、病毒顆粒、LNP） 等，還可以用于作常規(guī)動(dòng)物細(xì)胞檢測(cè) （如免疫細(xì)胞、哺乳類動(dòng)物細(xì)胞、等）。它是一臺(tái)全面且功能強(qiáng)大的納米流式分析儀！

參考文獻(xiàn)

OXFORD BIOLOGY Methods & Protocols,Biology Methods and Protocols,2024, bpae009
Advance Access Publication Date: 13 February 2024
Methods Article: Biomolecular, Structural and Biophysical AnalysisA methodological primer ofextracellular vesiclesisolation and characterization via different techniques

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