探究 RNA 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)效率低下的緣由

瀏覽次數(shù)：346　發(fā)布日期：2024-10-16　來(lái)源：威尼德生物科技

摘要：RNA 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)效率低下這一關(guān)鍵問(wèn)題，通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中多個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)的深入剖析，包括 RNA 質(zhì)量與結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)染試劑特性、細(xì)胞因素以及實(shí)驗(yàn)操作環(huán)境等方面的綜合研究，揭示了影響 RNA 轉(zhuǎn)染效率的潛在因素及其相互作用機(jī)制。旨在為生命科學(xué)領(lǐng)域中涉及 RNA 轉(zhuǎn)染的研究提供系統(tǒng)的理論支持和實(shí)踐指導(dǎo)，以優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案，提高轉(zhuǎn)染效率，推動(dòng)相關(guān)研究的順利開展。

一、引言

RNA 轉(zhuǎn)染作為生命科學(xué)研究中一項(xiàng)至關(guān)重要的技術(shù)手段，廣泛應(yīng)用于基因功能研究、疾病機(jī)制探索以及基因治療等多個(gè)領(lǐng)域。然而，在實(shí)際實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中，研究人員常常面臨 RNA 轉(zhuǎn)染效率低下的困擾，這嚴(yán)重制約了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，阻礙了相關(guān)研究的深入進(jìn)行。因此，深入探究 RNA 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)效率低下的緣由具有重要的科學(xué)意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

二、影響 RNA 轉(zhuǎn)染效率的因素分析
（一）RNA 質(zhì)量與結(jié)構(gòu)

RNA 純度
- RNA 樣本中若含有蛋白質(zhì)、DNA、有機(jī)溶劑等雜質(zhì)，會(huì)顯著影響轉(zhuǎn)染效率。例如，蛋白質(zhì)雜質(zhì)可能與 RNA 競(jìng)爭(zhēng)轉(zhuǎn)染試劑的結(jié)合位點(diǎn)，從而減少有效轉(zhuǎn)染復(fù)合物的形成；DNA 雜質(zhì)則可能干擾 RNA 與細(xì)胞內(nèi)受體的相互作用，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染過(guò)程受阻。
- 檢測(cè)方法：通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定 RNA 在 260nm、280nm 和 230nm 處的吸光值，計(jì)算 A260/A280 和 A260/A230 比值。純凈的 RNA 樣品，A260/A280 比值應(yīng)在 1.8 - 2.0 之間，A260/A230 比值應(yīng)大于 2.0。若比值偏離正常范圍，提示 RNA 可能存在雜質(zhì)污染。
RNA 完整性
- 降解的 RNA 分子結(jié)構(gòu)不完整，無(wú)法有效參與轉(zhuǎn)染過(guò)程中的一系列生物化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低。RNA 在提取、保存和處理過(guò)程中容易受到核糖核酸酶（RNase）的降解。
- 檢測(cè)方法：采用瓊脂糖凝膠電泳分析 RNA 的完整性。完整的 RNA 在凝膠上會(huì)呈現(xiàn)出清晰的 28S、18S 和 5S 核糖體 RNA 條帶，且 28S 條帶的亮度應(yīng)約為 18S 條帶的兩倍。若出現(xiàn)條帶模糊、拖尾或缺失等現(xiàn)象，則表明 RNA 可能已發(fā)生降解。
RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)
- RNA 分子具有復(fù)雜的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，某些特定的二級(jí)結(jié)構(gòu)可能會(huì)阻礙轉(zhuǎn)染試劑與 RNA 的結(jié)合，或者影響 RNA 進(jìn)入細(xì)胞后的解旋和釋放過(guò)程，從而降低轉(zhuǎn)染效率。
- 預(yù)測(cè)方法：利用生物信息學(xué)軟件如 RNAfold 等對(duì) RNA 序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。分析預(yù)測(cè)結(jié)果中是否存在可能影響轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)，如莖環(huán)結(jié)構(gòu)、發(fā)夾結(jié)構(gòu)等。對(duì)于具有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的 RNA，可以嘗試通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件（如提高轉(zhuǎn)染溫度、使用特殊的轉(zhuǎn)染試劑等）或?qū)?RNA 進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理（如熱變性等）來(lái)降低其對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響。

（二）轉(zhuǎn)染試劑特性

轉(zhuǎn)染試劑類型
- 不同類型的轉(zhuǎn)染試劑其轉(zhuǎn)染原理和適用范圍各不相同，對(duì) RNA 轉(zhuǎn)染效率的影響也存在差異。例如，陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑通過(guò)靜電作用與帶負(fù)電的 RNA 結(jié)合形成復(fù)合物，然后通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞；而聚合物轉(zhuǎn)染試劑則依靠其與 RNA 形成的納米顆粒來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞攝取。某些轉(zhuǎn)染試劑可能對(duì)特定類型的細(xì)胞或 RNA 具有更高的轉(zhuǎn)染效率。
- 選擇策略：在進(jìn)行 RNA 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前，需要充分了解不同轉(zhuǎn)染試劑的特點(diǎn)和適用范圍，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康�、�?xì)胞類型以及 RNA 的性質(zhì)等因素進(jìn)行合理選擇。同時(shí)，可以參考相關(guān)文獻(xiàn)或進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，比較不同轉(zhuǎn)染試劑在相同實(shí)驗(yàn)條件下的轉(zhuǎn)染效率，以確定最適合的轉(zhuǎn)染試劑。
轉(zhuǎn)染試劑毒性
- 轉(zhuǎn)染試劑在促進(jìn) RNA 進(jìn)入細(xì)胞的過(guò)程中，可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒性作用，影響細(xì)胞的正常生理功能和存活狀態(tài)，進(jìn)而導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率下降。高毒性的轉(zhuǎn)染試劑會(huì)引起細(xì)胞凋亡、形態(tài)改變、代謝紊亂等不良反應(yīng)，降低細(xì)胞對(duì) RNA 的攝取和處理能力。
- 評(píng)估方法：通過(guò)細(xì)胞活力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)如 MTT 法、CCK - 8 法等評(píng)估轉(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞的毒性。在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，設(shè)置不同濃度的轉(zhuǎn)染試劑處理組，同時(shí)設(shè)立未處理的對(duì)照組，在轉(zhuǎn)染后的特定時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)細(xì)胞活力。選擇在保證較高轉(zhuǎn)染效率的前提下，對(duì)細(xì)胞毒性較小的轉(zhuǎn)染試劑濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
轉(zhuǎn)染復(fù)合物穩(wěn)定性
- 轉(zhuǎn)染試劑與 RNA 形成的復(fù)合物在細(xì)胞培養(yǎng)液中的穩(wěn)定性對(duì)轉(zhuǎn)染效率至關(guān)重要。不穩(wěn)定的復(fù)合物可能在進(jìn)入細(xì)胞前就發(fā)生解離，導(dǎo)致 RNA 無(wú)法有效遞送到細(xì)胞內(nèi)。復(fù)合物的穩(wěn)定性受到多種因素的影響，如轉(zhuǎn)染試劑與 RNA 的比例、溶液的離子強(qiáng)度、pH 值等。
- 優(yōu)化方法：在制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物時(shí)，嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書的要求控制轉(zhuǎn)染試劑與 RNA 的比例。同時(shí)，注意優(yōu)化轉(zhuǎn)染過(guò)程中的溶液條件，保持適當(dāng)?shù)碾x子強(qiáng)度和 pH 值�？梢酝ㄟ^(guò)在不同條件下制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物，并檢測(cè)其在一定時(shí)間內(nèi)的穩(wěn)定性（如通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)測(cè)量復(fù)合物粒徑的變化等），來(lái)確定最佳的轉(zhuǎn)染復(fù)合物制備條件。

（三）細(xì)胞因素

細(xì)胞類型
- 不同類型的細(xì)胞其細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、表面受體表達(dá)、內(nèi)吞途徑以及代謝活性等方面存在顯著差異，這些因素都會(huì)影響 RNA 的轉(zhuǎn)染效率。例如，一些貼壁細(xì)胞如 HeLa 細(xì)胞、HEK293 細(xì)胞等相對(duì)容易轉(zhuǎn)染，而某些原代細(xì)胞或懸浮細(xì)胞則轉(zhuǎn)染難度較大。
- 應(yīng)對(duì)策略：針對(duì)不同類型的細(xì)胞，需要優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。對(duì)于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，可以嘗試采用特殊的轉(zhuǎn)染方法或轉(zhuǎn)染試劑，如電穿孔法、病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染等。此外，還可以通過(guò)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理（如使用細(xì)胞松弛素 B 等藥物增加細(xì)胞膜的通透性）或共轉(zhuǎn)染一些輔助因子（如陽(yáng)離子聚合物等增強(qiáng)細(xì)胞對(duì) RNA 的攝取能力）來(lái)提高轉(zhuǎn)染效率。
細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)
- 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞具有較強(qiáng)的代謝活性和分裂能力，對(duì) RNA 的攝取和處理能力也相對(duì)較高，因此轉(zhuǎn)染效率通常較高。而處于靜止期或老化狀態(tài)的細(xì)胞，其生理功能下降，轉(zhuǎn)染效率會(huì)受到明顯影響。
- 控制方法：在進(jìn)行 RNA 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前，確保細(xì)胞處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。定期傳代培養(yǎng)細(xì)胞，使細(xì)胞始終保持在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)和顯微鏡觀察等方法監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，選擇合適的細(xì)胞密度進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。一般來(lái)說(shuō)，細(xì)胞密度在轉(zhuǎn)染時(shí)應(yīng)達(dá)到 70% - 90% 左右，但具體密度還需根據(jù)細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行調(diào)整。
細(xì)胞 passages 次數(shù)
- 隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞可能會(huì)發(fā)生遺傳變異和表型改變，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)染效率逐漸下降。此外，長(zhǎng)期培養(yǎng)的細(xì)胞可能會(huì)積累一些細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的應(yīng)激因素，影響細(xì)胞的正常功能和對(duì) RNA 的響應(yīng)能力。
- 注意事項(xiàng)：盡量使用低 passages 次數(shù)的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，記錄細(xì)胞的傳代次數(shù)，并定期對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行檢測(cè)。如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率隨著 passages 次數(shù)的增加而明顯降低，應(yīng)重新復(fù)蘇早期 passages 的細(xì)胞或從可靠的細(xì)胞庫(kù)獲取新的細(xì)胞株。

（四）實(shí)驗(yàn)操作環(huán)境

無(wú)菌操作
- RNA 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)要求嚴(yán)格的無(wú)菌操作環(huán)境，以防止微生物污染對(duì)細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。微生物污染可能導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)異常、死亡或產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，從而干擾 RNA 轉(zhuǎn)染過(guò)程。例如，細(xì)菌或真菌產(chǎn)生的毒素可能影響細(xì)胞的膜通透性和代謝功能，降低轉(zhuǎn)染效率。
- 操作規(guī)范：在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，所有涉及細(xì)胞培養(yǎng)和 RNA 處理的操作均應(yīng)在無(wú)菌超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。使用無(wú)菌的培養(yǎng)器具和試劑，定期對(duì)超凈工作臺(tái)進(jìn)行清潔和消毒。在操作前，對(duì)手部進(jìn)行嚴(yán)格消毒，穿戴無(wú)菌手套和口罩。同時(shí)，注意避免將外界的微生物帶入實(shí)驗(yàn)環(huán)境，如避免在操作過(guò)程中頻繁打開超凈工作臺(tái)的門等。
溫度和濕度
- 實(shí)驗(yàn)環(huán)境的溫度和濕度對(duì) RNA 轉(zhuǎn)染效率也有一定的影響。溫度過(guò)高或過(guò)低可能影響細(xì)胞的生理狀態(tài)和代謝活性，進(jìn)而影響 RNA 的攝取和轉(zhuǎn)染效果。濕度不合適可能導(dǎo)致培養(yǎng)液蒸發(fā)過(guò)快或過(guò)慢，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境和轉(zhuǎn)染試劑的穩(wěn)定性。
- 控制條件：一般來(lái)說(shuō)，細(xì)胞培養(yǎng)和 RNA 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)應(yīng)在 37°C、5% CO₂的培養(yǎng)箱中進(jìn)行，培養(yǎng)箱內(nèi)的濕度應(yīng)保持在相對(duì)穩(wěn)定的水平（通常為 95% 左右）。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，定期檢查培養(yǎng)箱的溫度和濕度參數(shù)，確保其符合實(shí)驗(yàn)要求。如果實(shí)驗(yàn)環(huán)境的溫度和濕度波動(dòng)較大，可以考慮使用恒溫恒濕培養(yǎng)箱或在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)安裝空調(diào)和除濕設(shè)備等進(jìn)行調(diào)節(jié)。
震動(dòng)和干擾
- 在 RNA 轉(zhuǎn)染過(guò)程中，細(xì)胞培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿的震動(dòng)以及外界的電磁干擾等因素可能會(huì)影響轉(zhuǎn)染復(fù)合物與細(xì)胞的結(jié)合和攝取過(guò)程，從而降低轉(zhuǎn)染效率。例如，劇烈的震動(dòng)可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)染復(fù)合物從細(xì)胞表面脫落，而電磁干擾可能影響細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)和代謝過(guò)程，間接影響 RNA 轉(zhuǎn)染效果。
- 避免措施：在轉(zhuǎn)染過(guò)程中，盡量將細(xì)胞培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿放置在平穩(wěn)的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，避免不必要的震動(dòng)和移動(dòng)。同時(shí)，將實(shí)驗(yàn)設(shè)備遠(yuǎn)離強(qiáng)電磁場(chǎng)源，如電機(jī)、變壓器等。在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染操作時(shí)，創(chuàng)造一個(gè)安靜、穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)環(huán)境，以確保轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。

三、結(jié)論與展望

本研究通過(guò)對(duì) RNA 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中多個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)的詳細(xì)分析，揭示了導(dǎo)致 RNA 轉(zhuǎn)染效率低下的多種潛在因素，包括 RNA 質(zhì)量與結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)染試劑特性、細(xì)胞因素以及實(shí)驗(yàn)操作環(huán)境等方面。了解這些因素及其相互作用機(jī)制，對(duì)于優(yōu)化 RNA 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)方案、提高轉(zhuǎn)染效率具有重要的指導(dǎo)意義。在未來(lái)的研究中，一方面需要進(jìn)一步深入探究這些因素之間的復(fù)雜關(guān)系，建立更加完善的 RNA 轉(zhuǎn)染效率預(yù)測(cè)模型和優(yōu)化策略；另一方面，隨著生命科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，新型的轉(zhuǎn)染試劑和技術(shù)不斷涌現(xiàn)，需要持續(xù)關(guān)注和評(píng)估這些新技術(shù)在提高 RNA 轉(zhuǎn)染效率方面的應(yīng)用潛力和優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，跨學(xué)科的研究合作將有助于整合不同領(lǐng)域的知識(shí)和技術(shù)，為解決 RNA 轉(zhuǎn)染效率低下這一難題提供新的思路和方法。通過(guò)不斷的努力和創(chuàng)新，有望實(shí)現(xiàn) RNA 轉(zhuǎn)染技術(shù)的進(jìn)一步優(yōu)化和廣泛應(yīng)用，為生命科學(xué)研究和臨床治療等領(lǐng)域帶來(lái)更多的突破和進(jìn)展。

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