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細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中的討論熱點(diǎn)話(huà)題和常見(jiàn)疑問(wèn)解答

瀏覽次數(shù)：493　發(fā)布日期：2024-10-17　來(lái)源： MedChemExpress (MCE)

上期 MCE 細(xì)胞凋亡主題直播的 Q&A 匯總來(lái)啦！希望能為您提供有價(jià)值的見(jiàn)解和實(shí)用技巧~還為您準(zhǔn)備了萌家《細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》，干貨滿(mǎn)滿(mǎn)，附有相關(guān)產(chǎn)品支持您的凋亡相關(guān)實(shí)驗(yàn)！快來(lái)隨小 M 一起來(lái)看看吧~

01
實(shí)驗(yàn)手冊(cè)

叮叮~，針對(duì)上期教師節(jié)特約直播，小 M 為大家準(zhǔn)備了干貨滿(mǎn)滿(mǎn)的 《細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》，內(nèi)容涵蓋了細(xì)胞凋亡機(jī)制，各種經(jīng)典的檢測(cè)方法和相關(guān)檢測(cè)試劑，并有詳細(xì)的檢測(cè) Protocol 助力您的實(shí)驗(yàn)。

此外，MCE 還有更多產(chǎn)品指南，有需要的小伙伴可以速戳 ~

圖片丨MCE 產(chǎn)品指南

廢話(huà)不多說(shuō)！我們一起來(lái)看看上期凋亡直播的問(wèn)答匯總吧~

02
Q&A匯總

在上次直播中，小 M 帶著大家深入解析了三種主要的細(xì)胞凋亡相關(guān)知識(shí) (詳見(jiàn)往期直播：細(xì)胞凋亡：機(jī)制、標(biāo)志物與檢測(cè)方法的解決方案)。

在和各位老師們的深入探討中，有許多老師提出了許多精彩的問(wèn)題，小 M 也是精心整理了一份 Q&A 匯總，涵蓋了直播中討論的熱點(diǎn)話(huà)題和常見(jiàn)疑問(wèn)，快來(lái)隨小 M 一起看一下吧~

01
眾多細(xì)胞檢測(cè)凋亡的方式，該選哪一個(gè)呢？為什么選電鏡 (TEM) 的比較少，而選 Western blot 的比較多？

檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法有很多種，選擇哪種方法需要考慮實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹悠奉?lèi)型、檢測(cè)靈敏度、特異性、操作難度等因素。

1. 電子顯微鏡 (TEM) 的優(yōu)勢(shì)在于可以觀察到細(xì)胞凋亡的典型形態(tài)學(xué)變化,如染色質(zhì)凝聚、細(xì)胞質(zhì)縮小、細(xì)胞膜皺縮等，以及細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，但需要專(zhuān)業(yè)設(shè)備和技術(shù),操作復(fù)雜,樣品制備耗時(shí)。TEM 通常用于研究凋亡的形態(tài)學(xué)特征和機(jī)制，不適合大規(guī)模樣品檢測(cè)。

2. 常見(jiàn)的檢測(cè)方法是先用 Annexin V/PI 等方法進(jìn)行初步驗(yàn)證,再用 Western blot 等方法驗(yàn)證關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，Western blot 操作相對(duì)簡(jiǎn)單,可定量分析。

02
我想檢測(cè)血小板凋亡，可以用哪種凋亡檢測(cè)方式？

血小板的凋亡標(biāo)志物包括線(xiàn)粒體內(nèi)膜膜電位 (Δφm) 的去極化、細(xì)胞色素 c 的釋放、促凋亡和抗凋亡蛋白 Bcl-2 家族的表達(dá)含量變化、Caspase-3 的激活、磷脂酰絲氨酸 (PS) 的暴露、血小板收縮、碎裂成微粒、血小板表面的水泡和絲狀足擠壓等 (PMID: 22383127)。常用的檢測(cè)方法包括流式細(xì)胞術(shù)、Western blot 分析和電子顯微鏡 (TEM)，是檢查各種生理和病理環(huán)境中血小板凋亡的有用工具。

03
Annexin V/PI 雙染的流式細(xì)胞術(shù)中,四個(gè)象限的細(xì)胞分別代表什么狀態(tài)？

左上象限 Q1：Annexin V-/PI+，一般是機(jī)械損傷的細(xì)胞，如果這個(gè)象限的細(xì)胞特別多，需要排除實(shí)驗(yàn)操作異常。
右上象限 Q2：Annexin V+/PI+，此區(qū)域的細(xì)胞為晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。
右下象限 Q3：Annexin V+/PI-，此區(qū)域的細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞。
左下象限 Q4：Annexin V-/PI-，此區(qū)域的細(xì)胞為活細(xì)胞。

04
凋亡的熒光檢測(cè)方法中，流式細(xì)胞術(shù)和熒光顯微鏡檢測(cè)哪個(gè)結(jié)果更準(zhǔn)確一些呢？

在凋亡檢測(cè)中，流式細(xì)胞術(shù)和熒光顯微鏡檢測(cè)各有特點(diǎn)。

流式細(xì)胞術(shù)：可實(shí)現(xiàn)高通量分析，定量分析熒光強(qiáng)度，可實(shí)現(xiàn)對(duì)不同細(xì)胞群體的分析。但樣本處理相對(duì)復(fù)雜，可能導(dǎo)致細(xì)胞損失或結(jié)果偏差。

熒光顯微鏡：可以通過(guò)熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，提供形態(tài)學(xué)信息，操作簡(jiǎn)單，適合小規(guī)模實(shí)驗(yàn)。但通常只能分析有限數(shù)量的細(xì)胞，結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義較低，通常用于定性，難以進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析。

05
JC-1 一直染不出來(lái)是什么原因？改如何優(yōu)化實(shí)驗(yàn)？

建議增加陽(yáng)性對(duì)照 CCCP (HY-100941)，對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞，經(jīng) CCCP 處理后，線(xiàn)粒體膜電位會(huì)完全喪失，增加陽(yáng)性對(duì)照可以 JC-1 失效或者實(shí)驗(yàn)操作的問(wèn)題，然后再針對(duì)性的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

06
衰老細(xì)胞的線(xiàn)粒體膜通透性也會(huì)發(fā)生改變，檢測(cè)膜電位能區(qū)分凋亡和衰老嗎？

膜電位變化并不是凋亡或衰老的唯一指標(biāo)，建議結(jié)合其他檢測(cè)方法和生物標(biāo)志物的分析 (如 Annexin V/PI 染色、Caspase 活性檢測(cè)、活性氧水平/β-gal 活性檢測(cè)等)，有助于更準(zhǔn)確地評(píng)估細(xì)胞的生理狀態(tài)。

07
如果購(gòu)買(mǎi) MCE 細(xì)胞凋亡化合物庫(kù)，不用自己尋找目標(biāo)化合物嗎？是否只需要提供靶點(diǎn)通路由 MCE 來(lái)幫忙找？如何僅篩選其中的部分化合物呢？

MCE 細(xì)胞凋亡化合物庫(kù)（HY-L003）收錄了 2,400+ 種凋亡相關(guān)產(chǎn)品，主要靶向凋亡信號(hào)通路種主要靶點(diǎn)，可以用于細(xì)胞凋亡信號(hào)通路及相關(guān)疾病的研究。

1. 如果您僅需要其中某些靶點(diǎn)或者信號(hào)通路的化合物，MCE 可根據(jù)您的需求進(jìn)行匹配，定制您需要的化合物庫(kù)。另外，我們也提供一站式藥篩服務(wù)。

2. 如果您僅想篩選其中的部分化合物，也是可以根據(jù)您的需求定制的。比如，有些客戶(hù)只想做老藥，就可以保留 FDA 的，只想做新藥，就可以保留還沒(méi)上臨床的；比如有些客戶(hù)想要其中的代謝物或者天然產(chǎn)物等，因此，MCE 可根據(jù)您的需求來(lái)定制。

08
有的細(xì)胞凋亡抑制劑濃度過(guò)高或者處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，應(yīng)該怎么避免?

一般來(lái)說(shuō)，細(xì)胞凋亡抑制劑可以抑制細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的凋亡，但濃度過(guò)高或者處理時(shí)間長(zhǎng)可能會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生非特異性毒性、細(xì)胞代謝紊亂、激活其他細(xì)胞死亡通路 (如壞死性凋亡、自噬等)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡等。

建議您多查閱文獻(xiàn)，并設(shè)置濃度梯度實(shí)驗(yàn)和時(shí)間梯度，選用文獻(xiàn)報(bào)道的凋亡特異性抑制劑，以減少對(duì)其他細(xì)胞生理過(guò)程的干擾，并注意觀察細(xì)胞的形態(tài)、增殖和存活情況，確定最佳實(shí)驗(yàn)條件。

09
如果我想要通過(guò)抑制 P53 去抑制凋亡通路，有什么可用的抑制劑嗎？

有文獻(xiàn)表明，p53 可通過(guò)不同的途徑誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和凋亡 (PMID: 29149101)，抑制 p53 的研究主要集中在小分子抑制劑（如 PFT-α）和 RNA 干擾技術(shù)。

PFT-α (HY-15484) 是一種小分子抑制劑，能夠特異性抑制 p53 的活性。它通過(guò)與 p53 結(jié)合，阻止其轉(zhuǎn)錄激活功能，從而減少 p53 依賴(lài)的凋亡。在多種細(xì)胞模型中，PFT-α 被證明可以降低因化療藥物引起的細(xì)胞死亡。

此外，使用小干擾 RNA (siRNA) 或反義寡核苷酸 (ASO) 來(lái)特異性降低 p53 的表達(dá)，從而抑制其介導(dǎo)的凋亡。

10
Caspase 的抑制劑是通用的嗎？在選擇凋亡抑制劑時(shí)該如何選擇？

Caspase 抑制劑是廣泛應(yīng)用的細(xì)胞凋亡抑制劑，例如如 Ac-DEVD-cho, z-VAD-fmk, Z-IETD-fmk, Z-LEHD-fmk, 分別靶向 Caspase 3、泛-Caspase、Caspase 8、Caspase 9。然而，某些細(xì)胞和組織并不表達(dá)某種或者多種 Caspase，因此，首先要確定你的樣本中 (細(xì)胞或者組織) 是否有表達(dá)這個(gè) Caspase 蛋白，然后參考文獻(xiàn)中的處理濃度和時(shí)間，看文獻(xiàn)中有沒(méi)有相同或者類(lèi)似的模型，最終確定選擇哪個(gè)抑制劑比較合適。

11
細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死能夠同時(shí)存在嗎？

細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死能夠同時(shí)存在。

細(xì)胞死亡是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死是兩種不同的細(xì)胞死亡方式，細(xì)胞在不同的刺激下可能會(huì)經(jīng)歷不同的死亡途徑。但細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死也有共同存在的機(jī)制。

1. 在某些情況下，細(xì)胞可能同時(shí)經(jīng)歷凋亡和壞死。例如，在嚴(yán)重的氧化應(yīng)激或細(xì)胞損傷下，細(xì)胞可能首先激活凋亡通路，但由于損傷過(guò)于嚴(yán)重或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，最終轉(zhuǎn)變?yōu)閴乃?/span> (PMID: 11035261)。

2. 細(xì)胞凋亡和壞死的信號(hào)通路之間存在交叉。例如，在炎癥性疾病中，某些炎癥因子或細(xì)胞因子可以同時(shí)激活凋亡和壞死的相關(guān)信號(hào)通路 (PMID: 11997180)。

3. 在某些疾病 (如腫瘤、神經(jīng)退行性疾病等) 中，細(xì)胞凋亡和壞死也有可能同時(shí)發(fā)生，影響疾病的進(jìn)展和治療效果。

12
確定凋亡的發(fā)生后是否有必要確定是內(nèi)源或者外源的？

在某些情況下是必要的，確定是內(nèi)源性還是外源性的有助于研究細(xì)胞發(fā)生凋亡的具體機(jī)制，有助于藥物發(fā)現(xiàn)的研究。

例如，確定抗癌藥物誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的具體途徑可以明確抗癌機(jī)制，對(duì)臨床上的用藥具有一定的指導(dǎo)意義 (PMID: 33879127)。此外，凋亡的失調(diào)會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生，確定凋亡的具體機(jī)制有助于研究疾病的發(fā)病機(jī)制，助力藥物開(kāi)發(fā)。比如，F(xiàn)as 信號(hào)通路缺陷的 Lpr 和 gld 小鼠會(huì)出現(xiàn)淋巴結(jié)腫大和脾腫大，并發(fā)展出一種類(lèi)似于人類(lèi)系統(tǒng)性紅斑狼瘡 (SLE) 的疾病，表明外源性凋亡通路在自身免疫病研究中發(fā)揮著重要作用 (PMID: 22683550)。

凋亡檢測(cè)試劑盒，F(xiàn)ITC: 488/525 nm; PI: 535/617 nm。

JC-1 線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)試劑盒 (HY-K0601)

線(xiàn)粒體膜電位試劑盒，可用于早期細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

Cleaved-Caspase 3 p12 antibody (HY-P80623)

凋亡檢測(cè)抗體。Caspase-3 在凋亡時(shí)被剪切成 p17 和 p12 的兩個(gè)片段。

ABT-737 (HY-50907)

Bcl-2 抑制劑，引發(fā)內(nèi)源性凋亡。

Ac-DEVD-cho (HY-P1001)

Caspase 3 抑制劑，凋亡抑制劑。

z-VAD-fmk (HY-16658B)

泛-Caspase 抑制劑，凋亡抑制劑。

細(xì)胞凋亡化合物庫(kù) (HY-L003)