原核蛋白表達(dá)中表達(dá)載體的選擇及不同載體的優(yōu)缺點(diǎn)

在生命科學(xué)的探索之路上，原核蛋白表達(dá)重要的技術(shù)手段。然而，在這個過程中，科研人員常常面臨諸多難點(diǎn)。比如，蛋白表達(dá)量低得讓人沮喪，好不容易進(jìn)行實驗，卻發(fā)現(xiàn)經(jīng)過漫長的等待后只得到微量的產(chǎn)物；或者蛋白錯誤折疊，形成難以處理的包涵體，使得后續(xù)的純化和研究工作舉步維艱；又或者在選擇宿主菌和表達(dá)載體時感到迷茫，如同在迷霧中摸索，不知哪一個組合才是最佳選擇。那么，如何破解這些難題呢？關(guān)鍵就在于正確選擇原核蛋白表達(dá)的宿主菌和表達(dá)載體。你選對了嗎？讓我們一同深入探討，尋找開啟成功原核蛋白表達(dá)之門的鑰匙。

原核表達(dá)常用載體

1、pET 系列載體：
優(yōu)點(diǎn)：
高表達(dá)水平：是應(yīng)用非常廣泛的一類原核表達(dá)載體，具有高拷貝數(shù)，能使目的基因在大腸桿菌中實現(xiàn)高水平表達(dá)，適合需要大量蛋白的實驗。
調(diào)控精確：利用 T7 啟動子系統(tǒng)，T7 RNA 聚合酶具有很強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性，并且可以通過加入誘導(dǎo)劑（如 IPTG）來精確調(diào)控基因的表達(dá)，可調(diào)節(jié)基礎(chǔ)表達(dá)水平以優(yōu)化目標(biāo)基因的表達(dá)。
多種選擇：有多種載體–宿主菌組合可供選擇，并且有不同的融合標(biāo)簽和表達(dá)系統(tǒng)配置，還包含可溶性蛋白生產(chǎn)、二硫鍵形成、蛋白外運(yùn)和多肽生產(chǎn)等專用載體和宿主菌，能滿足不同的實驗需求。
克隆方便：許多載體以 LIC（連接非依賴的克�。┹d體試劑盒提供，可用于迅速定向克隆 PCR 產(chǎn)物，操作相對簡便。
缺點(diǎn)：
基礎(chǔ)表達(dá)：在某些情況下可能會出現(xiàn)基礎(chǔ)表達(dá)水平較高的現(xiàn)象，對于一些對蛋白表達(dá)量和時間要求非常嚴(yán)格的實驗，需要更精確地控制表達(dá)條件。
復(fù)雜操作：部分載體的構(gòu)建和操作相對復(fù)雜，需要對載體的特性和實驗操作有較好的理解和掌握。

2、pGEX 系列載體：
優(yōu)點(diǎn)：
易于純化：利用 tac 啟動子，表達(dá)時會表達(dá)出包含谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（GST）標(biāo)簽的融合蛋白。GST 標(biāo)簽可以與谷胱甘肽樹脂特異性結(jié)合，便于使用親和層析進(jìn)行純化，然后再用凝血蛋白酶或者 factor Xa 因子切割融合蛋白去除標(biāo)簽。
提高溶解性：GST 標(biāo)簽有助于增加外源蛋白的溶解度，對于一些難溶性蛋白的表達(dá)有一定幫助，能夠提高蛋白的穩(wěn)定性和可操作性。
嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控：該系列載體上有一個 lacIq 基因，能夠表達(dá)更多的阻遏蛋白以實現(xiàn)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼T導(dǎo)調(diào)控，降低本底表達(dá)。
缺點(diǎn)：
標(biāo)簽影響：GST 標(biāo)簽相對較大，可能會對目的蛋白的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生一定影響，在某些對蛋白純度要求極高的實驗中，去除標(biāo)簽的步驟可能會增加操作復(fù)雜性和時間成本2。

3、pBAD 和 pAraB 系列載體2：
優(yōu)點(diǎn)：
誘導(dǎo)表達(dá)：這些載體使用 araB 操縱子，可以用來在缺乏丙氨酸解氨酶的大腸桿菌突變株中，通過 L - 丙氨酸誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)，誘導(dǎo)條件相對溫和，對細(xì)胞的毒性較小。
可調(diào)控性：可以根據(jù)加入的 L - 丙氨酸的濃度來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)水平，實現(xiàn)一定程度的表達(dá)調(diào)控。
缺點(diǎn)：
表達(dá)水平：總體來說，其表達(dá)水平可能不如一些強(qiáng)啟動子的表達(dá)載體高，對于需要高產(chǎn)量蛋白的實驗可能不太適用。
宿主限制：需要特定的大腸桿菌突變株作為宿主，宿主的選擇范圍相對較窄。

4、pUC 系列載體：
優(yōu)點(diǎn)：
高拷貝數(shù)：含有 pMB1 復(fù)制子，具有較高的拷貝數(shù)，平均每個細(xì)胞可達(dá) 500 - 700 個拷貝，有利于獲取大量的質(zhì)粒。
篩選方便：具有來自大腸桿菌 lac 操縱子的 lacZ’基因，所編碼的 α- 肽鏈可參與 α- 互補(bǔ)作用，在 IPTG 誘導(dǎo)和底物 X-gal 存在下，可形成藍(lán)色和白色菌落，便于篩選重組體。
多克隆位點(diǎn)：具有多克隆位點(diǎn)區(qū)段（MCS），便于具有不同粘性末端的外源基因的插入，克隆操作相對簡單。
缺點(diǎn)：
表達(dá)量較低：主要是克隆載體，表達(dá)元件相對較少，表達(dá)水平相對其他專門的表達(dá)載體可能較低，一般更適合用于克隆和初步的基因操作5。

5、pBV220 系列載體：
優(yōu)點(diǎn)：
溫度調(diào)控：含有 clts857 基因（cl 基因的溫度敏感突變體），該基因表達(dá)的 Cl 蛋白能夠抑制啟動子 Pr 和 Pl，又對溫度敏感。所以該系列載體可以用溫度對外源基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控，無需添加誘導(dǎo)劑，減少了誘導(dǎo)劑對細(xì)胞的潛在影響。
非融合表達(dá)：SD 序列后面緊跟著就是多克隆位點(diǎn)，便于帶有起始密碼子 ATG 的外源基因的插入并表達(dá)成非融合蛋白，有利于保持目的蛋白的天然結(jié)構(gòu)和功能。
缺點(diǎn)：
熱休克影響：在溫度激活的過程中，大腸桿菌中的熱休克蛋白也會表達(dá)，可能會降解表達(dá)的外源蛋白，影響目的蛋白的產(chǎn)量和質(zhì)量。
調(diào)控不精確：溫度調(diào)控相對不如誘導(dǎo)劑調(diào)控精確，且對實驗環(huán)境的溫度控制要求較高，需要精確的溫度控制設(shè)備來保證實驗的重復(fù)性。

6、pT7 系列載體：
優(yōu)點(diǎn)：
強(qiáng)啟動子：以 T7 啟動子為核心，T7 啟動子具有非常高的轉(zhuǎn)錄效率，能夠驅(qū)動目的基因的高效表達(dá)，對于一些需要大量表達(dá)目的蛋白的實驗非常有利。

專一性強(qiáng)：T7 RNA 聚合酶只識別 T7 啟動子，具有很高的專一性，能夠避免其他雜蛋白的產(chǎn)生，提高目的蛋白的純度。

缺點(diǎn)：
宿主要求高：需要宿主細(xì)胞中含有 T7 RNA 聚合酶或者攜帶能夠表達(dá) T7 RNA 聚合酶的基因，如大腸桿菌 BL21（DE3）等特定的菌株，對宿主細(xì)胞的要求較高。

毒性問題：在某些情況下，T7 啟動子的高表達(dá)能力可能會對宿主細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒性，影響細(xì)胞的生長和存活，需要優(yōu)化表達(dá)條件來降低毒性影響。

表達(dá)載體選擇的考慮因素

1、目的蛋白的特性：
蛋白大�。喝绻�目的蛋白相對較小，可以選擇一般的高拷貝數(shù)載體，如 pUC 系列等；如果蛋白較大，可能需要選擇具有較強(qiáng)啟動子和翻譯效率的載體，以確保蛋白能夠順利表達(dá)。對于特別大的蛋白，還需考慮載體的承載能力和對蛋白表達(dá)的影響。
蛋白的疏水性：疏水性強(qiáng)的蛋白在表達(dá)過程中容易聚集形成包涵體，此時可選擇能促進(jìn)蛋白可溶性表達(dá)的載體，如 pGEX 系列等。GST 標(biāo)簽可以增加蛋白的溶解性，有助于提高疏水性蛋白的表達(dá)水平和可溶性。
是否含有特殊結(jié)構(gòu)：例如含有較多二硫鍵的蛋白，在原核表達(dá)系統(tǒng)中正確形成二硫鍵可能存在困難。對于這類蛋白，需要選擇能夠提供合適氧化還原環(huán)境的宿主菌以及相應(yīng)的表達(dá)載體，或者采用特殊的表達(dá)策略，如在較低溫度下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，以促進(jìn)二硫鍵的正確形成。如果目的蛋白是膜蛋白，其表達(dá)和折疊需要特定的膜環(huán)境，選擇的載體和宿主菌應(yīng)能夠在一定程度上模擬膜環(huán)境，或者選擇具有相關(guān)輔助蛋白的表達(dá)系統(tǒng)。

2、表達(dá)水平的需求：
強(qiáng)啟動子與高拷貝數(shù)：如果需要獲得高表達(dá)水平的蛋白，應(yīng)選擇具有強(qiáng)啟動子的載體，如 pET 系列載體中的 T7 啟動子，能夠使目的基因在大腸桿菌中實現(xiàn)高水平的表達(dá)。同時，高拷貝數(shù)的載體也有助于提高蛋白的表達(dá)量，但也要注意過高的拷貝數(shù)可能會對宿主細(xì)胞造成負(fù)擔(dān)12。
誘導(dǎo)條件的適配性：一些載體的啟動子需要特定的誘導(dǎo)劑和誘導(dǎo)條件才能實現(xiàn)高效表達(dá)。例如，pTrc 系列載體的 Trc 啟動子可以通過色氨酸的濃度來調(diào)控目的基因的表達(dá)；pBAD 和 pAraB 系列載體利用阿拉伯糖操縱子，通過 L - 丙氨酸誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)。根據(jù)實驗的便利性和對表達(dá)水平的精確調(diào)控需求，選擇合適的誘導(dǎo)系統(tǒng)1。

3、蛋白的純化需求：
純化標(biāo)簽的選擇：常見的純化標(biāo)簽有 His-tag（組氨酸標(biāo)簽）、GST-tag（谷胱甘肽 S - 轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽）、Flag-tag 等。His-tag 相對較小，對蛋白的結(jié)構(gòu)和功能影響較小，并且可以通過鎳柱親和層析進(jìn)行快速純化；GST-tag 較大，能提高蛋白的溶解性，但純化后可能需要去除標(biāo)簽，且純化過程相對復(fù)雜一些。如果后續(xù)實驗對蛋白的純度要求較高，需要選擇與純化方法相適配的標(biāo)簽和載體。
多標(biāo)簽系統(tǒng)：有些情況下，為了便于蛋白的純化、檢測或其他操作，可以選擇帶有多個標(biāo)簽的載體。例如，同時帶有 His-tag 和 Flag-tag 的載體，可以利用不同的純化方法進(jìn)行驗證和純化，提高蛋白的純度和可靠性。

4、宿主菌的特性：

宿主菌的兼容性：不同的原核表達(dá)載體適用于不同的宿主菌。例如，pET 系列載體通常與大腸桿菌 BL21 (DE3) 等具有 T7 RNA 聚合酶系統(tǒng)的菌株配合使用，能夠?qū)崿F(xiàn)高效表達(dá)；而一些特殊的宿主菌，如 Rosetta (DE3)，對稀有密碼子有較好的適應(yīng)性，適合表達(dá)含有稀有密碼子的外源基因。在選擇載體時，要確保其與所使用的宿主菌相兼容。

宿主菌的生長特性和培養(yǎng)條件：宿主菌的生長速度、培養(yǎng)溫度、營養(yǎng)需求等因素也會影響表達(dá)載體的選擇。例如，有些宿主菌在高溫下生長良好，對于需要在較高溫度下表達(dá)的蛋白，可以選擇適合該溫度條件的宿主菌和載體；而對于一些對溫度敏感的蛋白，則需要選擇在較低溫度下生長的宿主菌，以避免蛋白的變性和降解。

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