CAR-NK、CAR-M、CAR-NKT免疫療法相比CAR-T的優(yōu)勢和局限性

文章原創(chuàng):右邊 ， 文章來源：生信人

上回我們綜述了CAR-T治療的原理，對比了CAR-αβT和CAR-γδT治療的優(yōu)勢和局限性，以及在臨床試驗中的研究進展，其中提到了CRS（細胞因子釋放綜合征）和免疫抑制性腫瘤微環(huán)境等原因限制了CAR-T療法的有效性和安全性（具體請閱讀：CAR-T的T需要passion）。為了解決這些問題，研究人員已經(jīng)研究出了CAR-NK、CAR-NKT、CAR-M等CAR-免疫治療，這些療法使用的都是先天性免疫細胞，安裝上CAR后，可以通過抗原依賴性和抗原非依賴性途徑殺傷腫瘤細胞，為提高免疫治療療效和減輕毒副作用帶來了希望。

一、CAR-NK1、自然殺傷細胞NK

NK細胞是先天免疫系統(tǒng)中的一種淋巴細胞，具有產(chǎn)生大量的炎性細胞因子和快速而強大的細胞毒作用，可以在沒有事先致敏的情況下靶向和殺死癌細胞（即為先天免疫）。

NK細胞識別癌細胞的機制：“缺失自我”、“誘導自我”和抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。

①腫瘤細胞表面的MHC-I經(jīng)常缺乏或低表達，可觸發(fā)NK誘導的殺傷，稱為“缺失自我”識別。
②NK細胞可以識別應激細胞表面上調(diào)的配體，稱為“誘導自我”識別。
③抗體依賴性細胞毒性(ADCC)：NK細胞可以通過CD16 (FCγRIII)介導IgG調(diào)理的細胞毒作用，F(xiàn)CγRIII與IgG抗體的FC部分結(jié)合并誘導細胞毒性。

NK細胞殺傷癌細胞的機制：首先通過形成溶解性免疫突觸來消滅靶細胞，并分泌含有顆粒酶B和穿孔素的細胞溶解顆粒，導致靶細胞凋亡；然后通過死亡受體，如Fas配體和TNF相關(guān)凋亡誘導配體（TRAIL），誘導靶細胞死亡。此外，NK細胞可以產(chǎn)生多種促炎細胞因子，包括IFN-γ和TNF-α，以限制靶細胞的生長并協(xié)調(diào)其他先天和適應性免疫細胞的功能。

2、CAR-NK的構(gòu)建
T細胞的CAR結(jié)構(gòu)可以用于NK細胞（圖1）。
①第一代：具有單個 CD3ζ 信號結(jié)構(gòu)域，通常需要額外的共刺激信號才能獲得強大的細胞毒性反應。
②第二代：CAR 通過將單個共刺激結(jié)構(gòu)域（如 CD28、CD137 （4-1BB） 或 CD134 （OX40））與 CD3ζ 聯(lián)合來解決這個問題。
③第三代：CAR通過結(jié)合兩個與CD3ζ融合的共刺激結(jié)構(gòu)域進一步增強了活化和持久性。
④第四代：利用合成生物學來增強功能和安全性，這些包括整合用于自分泌激活的細胞因子基因和誘導型半胱天冬酶9系統(tǒng)作為管理效應細胞毒性的安全開關(guān)。

目前為了提高CAR-NK抗腫瘤的潛力，CAR-NK結(jié)構(gòu)仍然在不斷進行優(yōu)化，比如將一種靶向NK細胞特異性抑制受體的抑制性CAR(iCAR)引入NK細胞，防止NK細胞相互攻擊，以提高CAR-NK細胞的活性和壽命。

3、CAR-NK的優(yōu)勢
CAR-NK細胞相對于CAR-T細胞的潛在優(yōu)勢包括：
①與T細胞不同，NK細胞與降低GVHD 風險有關(guān)，因為NK細胞以HLA不受限制的方式發(fā)揮作用，即不需要供體和受體之間的完美匹配。這使得NK細胞成為同種異體細胞治療的選擇。
②NK細胞產(chǎn)生的促炎細胞因子水平低于T細胞，這降低了嚴重CRS的風險，CRS是一種全身性疾病，在最嚴重的病例中表現(xiàn)為全身癥狀、發(fā)熱、低血壓和器官功能障礙，它由細胞因子的大量釋放引發(fā)，IL-1 和 IL-6、CAR-T 細胞和TME在癌細胞識別后起著關(guān)鍵的致病作用。
③NK細胞具有抗原依賴性和抗原非依賴性方式（天然的細胞毒作用）識別和消除癌細胞。
④NK細胞識別并殺死具有下調(diào)MHC I類分子的細胞，這是癌細胞逃避T細胞檢測的常見機制。
⑤CAR-NK細胞在早期臨床試驗中證明了安全性和潛在療效，有望用于治療實體瘤，包括胃腸道癌。

4、CAR-NK的局限性和解決策略
CAR-NK細胞的首次大規(guī)模試驗結(jié)果表明，它們在CD19+慢性淋巴細胞白血病和B細胞淋巴瘤患者中的安全性和強大的臨床活性（NCT03056339）。如前所述，CAR-NK細胞作為癌癥免疫治療方案比CAR-T細胞具有多項優(yōu)勢。然而，CAR-NK細胞療法也面臨挑戰(zhàn)，例如靶抗原丟失、腫瘤異質(zhì)性、腫瘤免疫抑制微環(huán)境和CAR-NK細胞的持久性。因此，能最大限度地提高CAR-NK細胞療法療效的策略至關(guān)重要。

①CAR-NK細胞的靶抗原：CAR-NK細胞具有通過CAR依賴性途徑和天然機制（ADCC）對癌細胞發(fā)揮細胞毒作用的獨特能力，因此可以改變CAR的設(shè)計，利用NK細胞的天然細胞毒性途徑，從而降低對可能表達靶抗原的正常細胞造成損傷的風險。例如，可以設(shè)計缺乏共刺激結(jié)構(gòu)域的CAR，使CAR-NK細胞主要利用其先天性細胞毒性能力，同時最大限度地減少CAR誘導的直接細胞毒性。此外，NK細胞可以被修飾為攜帶非激活的CAR，該CAR不會直接觸發(fā)細胞毒性，而是增強NK細胞的靶向、粘附和向癌細胞的遷移。這種方法能夠靶向更廣泛的抗原，包括HER2、EGFR和間皮素。

②腫瘤異質(zhì)性：理想的靶標應在癌細胞上高表達，在正常組織中表達最少或沒有表達。這種特異性對于降低脫靶效應和相關(guān)毒性的風險至關(guān)重要。所以可以鑒定一組最優(yōu)的靶標，也可以開發(fā)多靶點CAR-NK細胞。

③腫瘤免疫抑制微環(huán)境：TME包含各種免疫抑制因子，包括缺氧、TGF-β、PGE-2以及阻礙免疫細胞活性的細胞外代謝物（如乳酸和腺苷），這些顯著阻礙了免疫細胞對腫瘤的破壞。因此，可以修飾NK細胞以抵抗這些抑制因子，例如，降低NK細胞上TGF-β受體II的表達已被證明可以部分抵消TME的負面影響，而不會影響抗白血病療效。

④CAR-NK細胞的持久性：CAR-NK細胞壽命較短，往往僅持續(xù)1-2周，在沒有細胞因子支持的情況下，它們的療效受到了極大的限制，而外源性細胞因子可能會引發(fā)副作用并激活其他免疫細胞，例如調(diào)節(jié)性T細胞，從而損害NK細胞的功能。應用基因工程技術(shù)，使NK細胞不僅攜帶CAR，還攜帶細胞因子、抗體和蛋白酶等激活劑，以促進其生長、運動和腫瘤滲透。例如，IL-15在NK細胞發(fā)育、存活和活化中起著至關(guān)重要的作用，表達IL-15的CAR-NK細胞在體內(nèi)表現(xiàn)出增強的持久性和抗腫瘤活性。

5、CAR-NK的應用
目前CAR-NK已經(jīng)在血液系統(tǒng)腫瘤和實體瘤中顯示出了可喜的療效，包括急性髓系白血病、淋巴瘤、肝細胞癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、胃癌、食管鱗狀細胞癌等。

例如，在胃癌中，HER2蛋白顯著過表達，研究人員設(shè)計了HER2-CAR-NK細胞，特異性靶向并破壞HER2陽性胃癌細胞，并產(chǎn)生更高水平的細胞因子。但是HER2-CAR-NK細胞在較大的實體瘤中的療效降低，深入研究表明，阿帕替尼治療可使NK細胞浸潤到更大的腫瘤中，從而提高HER2-CAR-NK細胞的治療效果。這種方法提出了一種通過將藥物治療與免疫細胞療法相結(jié)合來治療大腫瘤或耐藥性腫瘤的新策略，以改善整體治療結(jié)果。

二、CAR-M細胞1、巨噬細胞
巨噬細胞是主要的先天免疫細胞（激活先天性免疫），具有強大的吞噬能力、抗原呈遞活性、分泌細胞因子和趨化因子，以及穿透致密組織并在腫瘤中積累等多種特性。 這些屬性使巨噬細胞成為CAR免疫治療的潛在候選者。腫瘤相關(guān)巨噬細胞TAM有兩種類型，分別為M1和M2。

①M1巨噬細胞為抗腫瘤亞群，因為它們在吞噬癌細胞后釋放促炎因子和趨化因子，表現(xiàn)出抗原信號以激活CD4+T細胞和細胞毒性CD8+T細胞，從而激活機體免疫。并且M1巨噬細胞產(chǎn)生腫瘤殺傷分子，包括活性氧（ROS）和有毒一氧化氮（NO），對腫瘤細胞產(chǎn)生直接的細胞毒作用。

②M2巨噬細胞為促腫瘤亞群，可以產(chǎn)生IL-10、IL-4 和轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等抗炎細胞因子，高表達精氨酸酶1（Arg1）可以介導多胺合成和膠原蛋白形成，以及刺激腫瘤細胞生長和修復受損組織，它們還分泌血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）以促進腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。

2、TAM重編程
基于以上對巨噬細胞的介紹，研究人員對巨噬細胞進行重編程，使得TAM的表型從促腫瘤表型轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤表型（即M2重編程為M1）�？梢杂袃煞N策略：
①針對巨噬細胞極化信號通路：使用TLR激動劑、CSF1-R抑制劑、PI3K抑制劑和某些表觀遺傳學抑制劑。
②針對特定的TAM功能：通過靶向SIRP1α-CD47、LILRB1-β2M、Siglec10-CD24和PD1-PDL1等增強吞噬作用，還可以通過抑制Siglec1、PD-L1、MARCO 和LILRB2來靶向巨噬細胞免疫抑制活性。

重編程使巨噬細胞維持在M1表型，促進促炎細胞因子和ROS的分泌，吞噬能力的提高和巨噬細胞介導的CD8+T細胞、NK細胞和中性粒細胞的免疫功能的增強。

3、CAR-M的機制
基于以上認識，CAR-M的機制就是使巨噬細胞維持在M1抗腫瘤的狀態(tài)（目前臨床上CAR-M的細胞來源通常是外周血單核細胞和誘導多能干細胞），CAR-M通過釋放 TNF、NO 和 ROS 介導直接細胞毒作用（圖4a），也通過其表面的FcR與腫瘤細胞上包被的抗原肽結(jié)合來發(fā)揮ADCC和抗體依賴的吞噬作用ADP(圖4b)。當 CAR-M 將腫瘤抗原呈遞給輔助性 T 細胞并募集其他免疫細胞時，可以實現(xiàn)協(xié)同免疫反應(圖4c)。并且CAR-M可以根據(jù)CAR的設(shè)計發(fā)揮不同的作用，比如CCL19-CAR-M促進 CCR7 陽性腫瘤細胞的吞噬，從而減緩腫瘤進展和轉(zhuǎn)移；CD147-CAR-M觸發(fā) MMP產(chǎn)生以降解ECM，并促進更多的免疫細胞浸潤（圖4d）。

4、CAR-M的構(gòu)建
目前對CAR-M的設(shè)計結(jié)果表明，CAR-T的設(shè)計原則也適用于CAR-M，而細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域通常被修飾為包含促進巨噬細胞活化和極化的信號轉(zhuǎn)導基序。
①第一代CAR-M（圖5a、b和c）：
a. 將CD3ζ作為細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域可以促進CAR-M的能力。
b.細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域Megf10顯著增強吞噬作用，并且PI3K的加入進一步促進了吞噬能力。
c. 細胞內(nèi)CD147信號導致ECM降解，從而將更多的T細胞募集到TME。

②第二代CAR-M（圖5d、e和f）：
d. 利用腺病毒載體Ad5f35將抗HER2-CAR轉(zhuǎn)移到巨噬細胞中，使巨噬細胞向M1表型傾斜。
e. 誘導多能干細胞IPSC分化的巨噬細胞為CAR-M提供了充足的來源。表達CD86-FcRγ-CAR的巨噬細胞的抗腫瘤活性顯著增強，f. 表達CD3ζ-TIR-CAR的巨噬細胞可以維持長期的M1極化。

③第三代CAR-M（圖5g和h）：
g. 通過CAR-IFN-γ納米復合物將IFN-γ添加到細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，顯著增強抗腫瘤療效。
h. 攜帶RP-182肽的納米復合物不僅將巨噬細胞表型促進到M1，而且還將CAR-ErbB2基因遞送給巨噬細胞，從而改善其吞噬作用。

5、CAR-M的優(yōu)勢和面臨的問題
在這里研究人員比較了CAR-T、CAR-NK和CAR-M的優(yōu)勢和面臨的問題（圖6）。CAR-T面臨的GVHD和CRS、神經(jīng)毒性等副作用，而CAR-NK和CAR-M療法大大減少，部分是因為NK細胞和巨噬細胞是先天免疫細胞，安裝上CAR之后，具有抗原依賴性和自身天然的細胞毒作用來發(fā)揮抗腫瘤的作用，多重殺傷機制使得CAR-NK和CAR-M的毒副作用降低；細胞的擴增問題和缺乏腫瘤特異性抗原是三種療法均面臨的問題，這提示探索最優(yōu)的靶標（在癌細胞上高表達，而在正常細胞上低表達或不表達）對未來提高治療療效，減少毒副作用是至關(guān)重要的，這也符合精準醫(yī)療的準則。

（1）CAR-M的優(yōu)勢
①大量浸潤腫瘤組織的能力：細胞外基質(zhì)（ECM）由多種大分子蛋白、纖維分子、蛋白多糖、糖蛋白和糖胺聚糖組成，是大多數(shù)抗腫瘤治療（包括 CAR-T 和 CAR-NK 治療）的物理屏障。相比之下，巨噬細胞能夠通過分泌多種參與細胞外基質(zhì)降解的基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）來浸潤TME。
②很少發(fā)生重度CRS和神經(jīng)毒性。
③提高了抗原提呈的能力并促進了T細胞的細胞毒性作用（激活適應性免疫反應），有更強的吞噬活性和腫瘤殺傷能力。
④具有可靠的細胞來源和擴展擴增：目前臨床上CAR-M的細胞來源通常是外周血單核細胞和誘導多能干細胞。
⑤降低了靶標特異性非腫瘤毒性：這是由于CAR表達的瞬時性質(zhì)。

（2）面臨的問題
①高插入突變風險：CAR-M基因轉(zhuǎn)移主要通過病毒轉(zhuǎn)染進行，插入突變風險提高。
②缺乏腫瘤特異性抗原（這是CAR-T、CAR-NK、CAR-M均面臨的挑戰(zhàn)）
③靜脈輸入的巨噬細胞在體內(nèi)的遷移特性會嚴重影響治療效果。

6、CAR-M的突破
研究人員發(fā)現(xiàn)CAR-M和CAR-T可以在體外協(xié)同殺死腫瘤細胞。CAR-T細胞分泌的細胞因子，如IFN-γ和GM-CSF，可以將巨噬細胞轉(zhuǎn)化為M1表型，從而增強CAR-M的細胞毒性。同時，這些細胞因子可以觸發(fā)CAR-M上CD80或CD86的上調(diào)，這反過來又可能通過CD28正向調(diào)節(jié)CAR-T細胞的細胞毒能力。此外，當CAR-T和CAR-M共培養(yǎng)時，IFN-γ、IL-1β、CXCL1、MIP-2、IL-6和單核細胞趨化蛋白（MCP）-1等細胞因子的水平急劇增加，可能在體內(nèi)形成炎癥TME。CAR-T和CAR-M的協(xié)同效應表明聯(lián)合治療癌癥治療的可行性。此外，CAR-M的腫瘤浸潤能力可能會將更多的CAR-T細胞募集到腫瘤部位，并發(fā)揮強大的腫瘤殺傷能力。

三、CAR-NKT細胞
1、NKT細胞
NKT細胞稱為自然殺傷T細胞，其細胞表面同時表達T細胞受體TCR和NK細胞受體。NKT細胞能大量產(chǎn)生細胞因子，且可以發(fā)揮與NK細胞相似的細胞毒作用（這里我們應該想到CAR-NKT的CRS和神經(jīng)毒性也是大大降低的），即NKT細胞可以調(diào)節(jié)先天性免疫和特異性免疫。

2、CAR-NKT抗腫瘤的機制（與CAR-γδT對比）
CAR-γδT 和CAR-NKT細胞都可以通過 CAR-、ADCC-、Fas/FasL-、TRAIL 和 TNFR 介導的方式殺死腫瘤細胞，并可以通過分泌細胞因子來動員其他免疫細胞。CAR-γδT 細胞也可以被選定的受體激活，而 CAR-NKT 細胞的激活受體僅限于CD1d。此外，CAR-γδT 細胞可以將抗原呈遞給 T 細胞，CAR-NKT 細胞可以促進樹突狀細胞成熟并被樹突狀細胞激活。

3、CAR-NKT的優(yōu)勢
CAR-NKT細胞療法由于其NK細胞和T細胞雙重特性的優(yōu)勢，可以彌補CAR-T細胞療法的缺點。
①CRS減少：與傳統(tǒng)的CAR-T細胞療法相比，CAR-NKT細胞療法具有與CAR-T細胞相當?shù)哪[瘤細胞毒性，但CRS等副作用明顯減少。
②多種機制殺傷腫瘤細胞：CAR-NKT細胞可以通過CAR和CD1d依賴性機制雙重特異性殺傷能力（NKT細胞殺傷依賴于靶細胞CD1d的表達，因此NKT對CD1d陰性腫瘤細胞無效；但是，將其與CAR結(jié)合使用可以彌補這一限制）；也可以通過FASL、TNF-α、TRAIL和穿孔素/顆粒酶以靶點非依賴性方式直接殺死腫瘤細胞，這使得它們更適用于消除異質(zhì)性腫瘤。
③改善腫瘤微環(huán)境：CAR-NKT細胞可以通過啟動Th1/Th2細胞因子級聯(lián)反應來募集和激活其他免疫細胞，包括激活NK細胞和成熟的樹突狀細胞以刺激細胞毒性T淋巴細胞并抑制TAM。
④不會誘導GvHD：NKT細胞識別CD1d，一種非經(jīng)典的MHC-I樣分子，因此，CAR-NKT細胞療法不會誘導GvHD。

4、CAR-NKT面臨的挑戰(zhàn)及解決方案
①與CAR-γδT一樣，面臨數(shù)量少、擴增困難的問題。研究人員發(fā)現(xiàn)，將iNKT TCR基因工程化為造血干細胞（HSC），以生成工程化iNKT細胞。這些HSC-iNKT細胞與內(nèi)源性iNKT細胞非常相似，在體內(nèi)有效抑制多發(fā)性骨髓瘤和黑色素瘤異種移植物的生長。
②持久性差。CAR-NKT細胞注入體內(nèi)后活性和增殖逐漸下降，需要多次輸注CAR-NKT細胞才能達到預期的治療效果，這加劇了NKT細胞數(shù)量少的問題。有研究表明CD62L NKT細胞在小鼠模型中具有更好的持久性和抗腫瘤活性。

5、CAR-NKT的應用
到目前為止，只注冊了5項CAR-NKT臨床試驗。其中，靶向GD2的自體CAR-NKT細胞用于治療復發(fā)或耐藥性神經(jīng)母細胞瘤的I期臨床試驗結(jié)果（NCT03294954）顯示：通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導從3例患者的外周血單個核細胞中產(chǎn)生CAR-NKT細胞，并分別擴增了15、14和9天，分泌IL-15的CAR-NKT細胞輸注患者后在體內(nèi)擴增，有效浸潤腫瘤部位，介導腫瘤消退。3例患者中有1例達到CR，骨轉(zhuǎn)移消退，無患者出現(xiàn)明顯的副作用。這項研究表明，盡管NKT細胞在外周血中很少見，但可以進行基因修飾以表達CAR，在臨床規(guī)模上擴增，并安全地用于治療患者。

結(jié)論
不同于T細胞，NK細胞、巨噬細胞、NKT細胞都是先天性免疫細胞，本身都具有先天的細胞毒作用，可以在事先沒有致敏的情況下迅速作出反應。這些細胞安裝上CAR結(jié)構(gòu)之后，就擁有了抗原依賴性和本身的細胞毒作用兩種殺傷腫瘤的機制，研究人員重新設(shè)計CAR結(jié)構(gòu)，可以最大程度的降低CAR引發(fā)的毒副作用，同時最大程度的激發(fā)這些細胞本身的天然抗腫瘤作用，這樣就做到了提高療效的同時減少了毒副作用。但是細胞數(shù)量少、擴增困難、缺乏特異性抗原是CAR免疫療法共同面臨的問題，這也指給了我們未來的研究方向，解決這些問題，CAR-免疫療法將更上一層樓。

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