小鼠模型在揭秘乳酸化修飾調(diào)控先天性免疫新機(jī)制中的應(yīng)用

2024年9月25日，浙江大學(xué)張龍教授團(tuán)隊(duì)在Nature雜志上在線發(fā)表了題為：AARS1 and AARS2 sense L-lactate to regulate cGAS as global lysine lactyltransferases的最新研究成果。該研究首次闡明胞內(nèi)乳酸如何被感知并介導(dǎo)蛋白乳酸化修飾的具體過程。

南模生物為該研究定制了cGAS-K156R敲入小鼠(cGAS^KR/KR)、cGAS-K156Q敲入小鼠(cGAS^KQ/KQ)以及Lyz-Cre小鼠。

近年來，生物學(xué)領(lǐng)域取得了重大突破，確定了一種新的翻譯后修飾過程——乳酸化，這種修飾并不局限于特定的蛋白質(zhì)，它可以出現(xiàn)在組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)分子、酶和底物等不同的蛋白類型上。乳酸化在調(diào)控基因表達(dá)、蛋白質(zhì)功能、腫瘤微環(huán)境等多種生物學(xué)過程中起著重要作用。由此可見，對(duì)乳酸化作用的分子機(jī)制及其調(diào)控功能的研究將成為未來的熱點(diǎn)。
 

乳酸化修飾過程 (Jing F, et al., 2024)
 

cGAS是體內(nèi)核苷酸轉(zhuǎn)移酶，能夠催化GTP和ATP形成環(huán)狀GMP-AMP（cGAMP），并通過激活STING觸發(fā)天然免疫反應(yīng)，介導(dǎo)抗病毒抗腫瘤作用。蛋白質(zhì)的翻譯后修飾對(duì)cGAS的調(diào)控作用具有重要意義，同時(shí)有研究表明，乳酸堆積往往與腫瘤和免疫系統(tǒng)紊亂疾病的預(yù)后不良相關(guān)，且L-乳酸能乳酸化修飾蛋白質(zhì)。那么，L-乳酸是否會(huì)乳酸化修飾cGAS？胞內(nèi)積累的乳酸是如何被感知的？又存在怎樣的機(jī)制使L-乳酸對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行乳酸化修飾呢？

對(duì)于這些科學(xué)問題，張龍教授團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了以下研究來回答：

1.乳酸化的cGAS功能被抑制
作者發(fā)現(xiàn)臨床上感染人巨細(xì)胞病毒（HCMV）的患者群體中，血清L-乳酸水平正常的個(gè)體相較于高乳酸血癥（H-Lac）或乳酸酸中毒（LA）的患者，其血清中cGAMP和IFNβ的濃度顯著升高。同時(shí)，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，L-乳酸處理可提高cGAS的乳酸化水平，降低cGAS催化cGAMP產(chǎn)生的活性。

Fig1. MCT1介導(dǎo)的L-乳酸攝取模型，通過未知的細(xì)胞內(nèi)L-乳酸傳感器和乳酰轉(zhuǎn)移酶催化cGAS的乳酸化，從而抑制cGAMP的合成。

2.AARS1/2是L-乳酸的感受器
為確定細(xì)胞內(nèi)L-乳酸的感受器及催化cGAS乳酸化的蛋白，作者進(jìn)行了全基因組CRISPR篩選。進(jìn)一步利用乳酸化修飾組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)敲低丙氨酰-tRNA合成酶1或2（AARS1/2）可抑制L-乳酸誘導(dǎo)的乳酸化修飾水平，過表達(dá)AARS1/2則結(jié)果相反。以上結(jié)果提示，AARS1/2是細(xì)胞內(nèi)的乳酸傳感器，并對(duì)蛋白質(zhì)組賴氨酸的乳酸化修飾具有關(guān)鍵作用。
 

Fig2. 全基因組CRISPR篩選發(fā)現(xiàn)AARS1/2是細(xì)胞內(nèi)的乳酸傳感器。

3.AARS1/2是ATP依賴的乳酸轉(zhuǎn)移酶
作者進(jìn)一步探究了AARS1/2調(diào)控蛋白質(zhì)賴氨酸乳酸化的具體機(jī)制：L-乳酸被AARS以ATP依賴的方式激活，生成中間體乳酸-AMP，然后將乳酸基團(tuán)Lac轉(zhuǎn)移至目標(biāo)蛋白質(zhì)N端特定的賴氨酸殘基上。AARS1/2與L-乳酸結(jié)合，直接催化L-乳酸在賴氨酸受體端進(jìn)行ATP依賴性的乳酸化。該模式能夠?qū)⑵咸烟堑拇�謝產(chǎn)物L(fēng)-乳酸和ATP共價(jià)修飾到蛋白質(zhì)上，直接改變重要蛋白質(zhì)的功能。在L-乳酸的作用下，AARS2與cGAS結(jié)合，在細(xì)胞和小鼠模型中介導(dǎo)cGAS的乳酸化，導(dǎo)致cGAS失活。
 

Fig3. AARS1/2通過兩步反應(yīng)以ATP依賴的方式催化L-乳酸對(duì)蛋白質(zhì)的乳酸化修飾。

4.AARS2在體內(nèi)介導(dǎo)cGAS乳酸化
作者又進(jìn)一步探究了AARS1/2對(duì)cGAS的乳酸化修飾作用。結(jié)果表明，在人和小鼠細(xì)胞中，AARS2（而非AARS1）介導(dǎo)了cGAS的乳酸化，進(jìn)而抑制了cGAS的活性。

為明確cGAS蛋白N端乳酸化對(duì)cGAS蛋白的影響，作者開發(fā)了一種遺傳密碼子拓展正交系統(tǒng)。該系統(tǒng)可將乳酸化賴氨酸插入重組cGAS蛋白中，以實(shí)現(xiàn)體外的cGAS乳酸化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未乳酸化的cGAS對(duì)干擾素刺激DNA的結(jié)合能力高于乳酸化的cGAS。且未乳酸化的cGAS與DNA形成的液滴更大、熒光強(qiáng)度更高，具有更好的可逆性。而在體外與100bp DNA或HT-DN孵育后，未乳酸化的cGAS合成cGAMP的能力增強(qiáng)，乳酸化的cGAS則相反。未乳酸化的cGAS與DNA形成的液滴具有高度的擴(kuò)散性和滲透性，而乳酸化的cGAS則排斥DNA，自聚集成凝膠狀液滴，表現(xiàn)出較低的擴(kuò)散和滲透性。以上結(jié)果提示，cGAS特定N端賴氨酸的乳酸化使其失去液液相分離（LLPS）的能力和酶活性。

為進(jìn)一步明確為什么cGAS乳酸化后會(huì)轉(zhuǎn)而排斥DNA，作者分別比較了cGAS與DNA及自身蛋白的親和力。結(jié)果表明，未乳酸化的cGAS與DNA的親和力顯著高于與自身結(jié)合的親和力，而乳酸化的cGAS由于正電荷的損失降低了其對(duì)DNA的親和力，故而排斥DNA。
 

Fig4. 未乳酸化的cGAS可以有效地與DNA形成LLPS，而乳酸化的cGAS排斥DNA并在富含DNA的環(huán)境中自聚集形成凝膠狀液滴。

5.乳酸化修飾消除了cGAS對(duì)DNA的識(shí)別，阻斷MCT1可恢復(fù)此過程。
接下來研究者分別構(gòu)建了cGAS-K156Q基因敲入小鼠模型(cGAS^KQ/KQ)和cGAS-K156R基因敲入小鼠模型(cGAS^KR/KR)在小鼠體內(nèi)模擬乳酸化和去乳酸化修飾。

用HSV-1感染小鼠后，研究者們發(fā)現(xiàn)cGAS^KQ/KQ小鼠具有更嚴(yán)重的肺部損傷和更高的死亡率；而cGAS^KR/KR小鼠呈現(xiàn)較輕的肺部損傷和低死亡率。這提示cGAS的乳酸化在體內(nèi)具有免疫抑制功能。此研究還測(cè)試了多種方法以挽救由高水平L-乳酸引發(fā)的固有免疫監(jiān)視逃逸，最終發(fā)現(xiàn)MCT1抑制劑AZD能夠通過阻斷L-乳酸進(jìn)入固有免疫細(xì)胞，恢復(fù)cGAS活性和細(xì)胞固有免疫功能。

在HSV-1感染患者中，患有焦慮癥的患者的血清中有較高的L-乳酸水平，以及較低的cGAMP和IFNβ濃度。這些數(shù)據(jù)表明，L-乳酸介導(dǎo)的cGAS抑制可能與焦慮引起的免疫監(jiān)視不良有關(guān)。為驗(yàn)證以上猜想，研究者構(gòu)建焦慮小鼠模型，發(fā)現(xiàn)焦慮小鼠血清中L-乳酸水平均顯著升高，且對(duì)病毒的易感性增加。而使用MCT1抑制劑，可阻斷L-乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入固有免疫細(xì)胞，從而維持細(xì)胞質(zhì)DNA感知和固有免疫監(jiān)視。
 

Fig5. cGAS乳酸化抑制免疫監(jiān)視，可以通過阻斷MCT1來挽救此過程。

總之，作者團(tuán)隊(duì)將AARS1/2確立為細(xì)胞內(nèi)L-乳酸傳感器和乳酰轉(zhuǎn)移酶，AARS1/2在L-乳酸誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)組范圍的乳酸化作用中至關(guān)重要。作者還在分子水平上描述了AARS1/2如何催化L-乳酸與賴氨酸的ATP依賴性結(jié)合。高水平的L-乳酸可通過AARS2使cGAS乳酸化，進(jìn)而降低了機(jī)體的固有免疫。該研究開創(chuàng)性地提供了對(duì)L-乳酸和乳酸化的新見解，將為未來的研究鋪平道路。

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