重組小鼠白介素 2 基因真核轉(zhuǎn)染表達(dá)

摘要：
本研究旨在構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pIRESneo2/mIL-2，并在哺乳類工程細(xì)胞C2C12中實(shí)現(xiàn)持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)小鼠白介素2（mIL-2）。通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入重組載體，經(jīng)Western blots驗(yàn)證成功表達(dá)mIL-2。本研究為mIL-2的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供了重要基礎(chǔ)，具有重要的學(xué)術(shù)和應(yīng)用價(jià)值。

引言：
白介素2（IL-2）是一種重要的細(xì)胞因子，屬于白介素家族，對(duì)免疫系統(tǒng)具有顯著的調(diào)節(jié)作用。IL-2能夠刺激和增強(qiáng)T細(xì)胞的增殖和活化，促進(jìn)免疫細(xì)胞亞群的分化和功能調(diào)節(jié)，因此在免疫學(xué)研究中具有重要地位。重組小鼠IL-2（rmIL-2）是通過(guò)基因工程技術(shù)制備的小鼠IL-2蛋白，在研究和治療領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用，并展示出潛在的生物活性和臨床應(yīng)用價(jià)值。

然而，要實(shí)現(xiàn)rmIL-2的穩(wěn)定表達(dá)和高純度制備，需要構(gòu)建高效的轉(zhuǎn)化體系。真核表達(dá)系統(tǒng)因其能夠模擬天然蛋白的合成和修飾過(guò)程，成為制備重組蛋白的理想選擇。哺乳動(dòng)物細(xì)胞作為真核表達(dá)系統(tǒng)的一種，具有翻譯后修飾完善、表達(dá)產(chǎn)物生物活性高等優(yōu)點(diǎn)。因此，本研究選擇哺乳動(dòng)物細(xì)胞C2C12作為表達(dá)宿主，構(gòu)建重組真核表達(dá)載體，以期實(shí)現(xiàn)rmIL-2的持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)。

材料與方法：

1. 材料：
   • 質(zhì)粒：真核表達(dá)質(zhì)粒pIRESneo2（購(gòu)自某試劑公司）。
   • 細(xì)胞系：C2C12小鼠成肌細(xì)胞系（購(gòu)自某試劑公司）。
   • 試劑：限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（購(gòu)自某試劑公司）、RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、抗生素等。
   • 儀器：某品牌電泳儀、某品牌離心機(jī)、某品牌CO₂培養(yǎng)箱、某品牌熒光倒置顯微鏡、威尼德電穿孔儀、某品牌蛋白印跡系統(tǒng)（Western blots）。
2. 方法：
   • 重組載體的構(gòu)建：利用RT-PCR技術(shù)從小鼠脾臟組織中擴(kuò)增mIL-2 cDNA片段，通過(guò)限制性內(nèi)切酶酶切和DNA連接酶連接，將其插入真核表達(dá)質(zhì)粒pIRESneo2中，構(gòu)建成重組表達(dá)載體pIRESneo2/mIL-2。利用電泳和測(cè)序技術(shù)對(duì)重組載體進(jìn)行驗(yàn)證。
   • 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：將C2C12細(xì)胞培養(yǎng)在含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO₂條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將重組載體pIRESneo2/mIL-2導(dǎo)入C2C12細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
   • 表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)：轉(zhuǎn)染后第30天，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解液，利用Western blots技術(shù)檢測(cè)mIL-2的表達(dá)情況。以未轉(zhuǎn)染的C2C12細(xì)胞作為陰性對(duì)照，以商業(yè)化的rmIL-2作為陽(yáng)性對(duì)照。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1. 重組載體的驗(yàn)證：
   經(jīng)過(guò)電泳和測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果顯示mIL-2 cDNA片段已成功插入真核表達(dá)質(zhì)粒pIRESneo2中，且插入方向和堿基組成順序均準(zhǔn)確無(wú)誤。重組載體pIRESneo2/mIL-2構(gòu)建成功。

2. 表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)：
   轉(zhuǎn)染后第30天，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解液進(jìn)行Western blots檢測(cè)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染重組載體pIRESneo2/mIL-2的C2C12細(xì)胞系能夠表達(dá)mIL-2，且表達(dá)產(chǎn)物與商業(yè)化rmIL-2的分子量一致，具有較高的生物活性。而未轉(zhuǎn)染的C2C12細(xì)胞則未檢測(cè)到mIL-2的表達(dá)。

討論：

1. 重組載體的構(gòu)建策略：
   本研究采用分子克隆技術(shù)，將mIL-2 cDNA片段插入真核表達(dá)質(zhì)粒pIRESneo2中，構(gòu)建了重組表達(dá)載體pIRESneo2/mIL-2。該載體具有多克隆位點(diǎn)、強(qiáng)啟動(dòng)子和選擇標(biāo)記等特點(diǎn)，能夠高效、穩(wěn)定地表達(dá)目的基因。同時(shí)，通過(guò)電泳和測(cè)序驗(yàn)證，確保了重組載體的準(zhǔn)確性和可靠性。

2. 轉(zhuǎn)染效率與表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)：
   本研究采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組載體導(dǎo)入C2C12細(xì)胞中，該方法操作簡(jiǎn)便、轉(zhuǎn)染效率高。轉(zhuǎn)染后第30天，利用Western blots技術(shù)檢測(cè)到了mIL-2的表達(dá)，且表達(dá)產(chǎn)物具有較高的生物活性。這表明重組載體能夠在C2C12細(xì)胞中成功表達(dá)mIL-2，為后續(xù)的純化和應(yīng)用提供了重要基礎(chǔ)。

3. 重組小鼠白介素2的潛在應(yīng)用：
   重組小鼠白介素2在研究和治療領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。在免疫學(xué)研究中，rmIL-2可作為研究免疫調(diào)節(jié)、免疫應(yīng)答和免疫細(xì)胞功能的工具。在臨床應(yīng)用方面，rmIL-2被探索作為免疫相關(guān)疾病和腫瘤治療的潛在策略。例如，它可以用于治療某些自身免疫病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等；此外，rmIL-2也被用于腫瘤免疫治療，以增強(qiáng)患者免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤的攻擊能力。

4. 研究的創(chuàng)新與應(yīng)用前景：
   本研究成功構(gòu)建了重組真核表達(dá)載體pIRESneo2/mIL-2，并在C2C12細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)mIL-2。這一成果不僅為mIL-2的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供了重要基礎(chǔ)，同時(shí)也為真核表達(dá)系統(tǒng)在重組蛋白制備中的應(yīng)用提供了新的思路和方法。隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，重組小鼠白介素2的制備和應(yīng)用將更加廣泛和深入。