時(shí)空組學(xué)研究進(jìn)展（六）：單細(xì)胞多組學(xué)測序技術(shù)的介紹

 

單細(xì)胞多組學(xué)測序技術(shù)
通過單細(xì)胞多組學(xué)技術(shù)，可以分析同一細(xì)胞的多種類型的分子。近年來，人們開發(fā)了多種單細(xì)胞測序方法，用于捕獲基因組DNA（gDNA）、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和表觀基因組。單細(xì)胞多組學(xué)測序技術(shù)工作流程的主要步驟如圖13所示。
 

圖13 單細(xì)胞多組學(xué)測序技術(shù)的主要實(shí)驗(yàn)流程

1. 轉(zhuǎn)錄組+gDNA
目前已有多種技術(shù)可以同時(shí)測量單個(gè)細(xì)胞中的mRNA和gDNA。G&T-seq（Genome and transcriptome sequencing）應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分離細(xì)胞，使用beads分離細(xì)胞中的mRNA和gDNA。DR-seq（gDNA-mRNA sequencing）通過移液管分選細(xì)胞，然后分離和擴(kuò)增標(biāo)記的gDNA和mRNA。SIDR技術(shù) (Simultaneous isolation of genomic DNA and total RNA)使用微孔板分選細(xì)胞，并通過低滲胞飲法分離細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。TARGET-seq技術(shù)優(yōu)化了FACS的細(xì)胞分離和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）擴(kuò)增步驟，提高了細(xì)胞通量。

2. 轉(zhuǎn)錄組+表觀基因組
亞硫酸氫鹽（BS）處理可以轉(zhuǎn)化發(fā)生甲基化和未發(fā)生甲基化的DNA CG位點(diǎn)，并通過PCR和二代測序在單核苷酸分辨率上分析DNA甲基化�；�于該原理，目前已經(jīng)開發(fā)了多種單細(xì)胞甲基化測序技術(shù)，用于檢測單細(xì)胞水平上的甲基化修飾水平，包括scRRBS、scWGBS、snmC-seq和sci-MET。同樣的，目前已開發(fā)多種單細(xì)胞多組學(xué)技術(shù)，捕獲同一細(xì)胞中的mRNA和gDNA的甲基化。首先，scM&T -seq（single-cell methylome and transcriptome sequencing）使用與G&T-seq類似的方法，利用流式分離細(xì)胞，基于beads分離細(xì)胞的mRNA和gDNA，然后進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理。scMT-seq（simultaneous single-cell methylome and transcriptome sequencing）使用微量移液法從單細(xì)胞裂解物中分離細(xì)胞核，并通過scRRBS和改良的Smart-seq2流程分別生成DNA甲基化和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。此外，scTrio-seq可以分析同一細(xì)胞中的基因組CNVs、DNA甲基化和轉(zhuǎn)錄組，其中基因組CNVs可以通過大量RRBS數(shù)據(jù)從scRRBS中計(jì)算推斷出來。

多種基于二代測序的技術(shù)，如ChIPseq、Dnase -seq、ATAC-seq，用于研究表觀基因組圖譜，如染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和組蛋白修飾。另一種類似的方法，NOMe-Seq (Nucleosome Occupancy and Methylome Sequencing)可以使用外源性M. CviPI GpC甲基轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記開放的基因組區(qū)域，同時(shí)測定核小體占位和甲基化水平。在這些方法的基礎(chǔ)上，還開發(fā)了許多新的技術(shù)來測量染色質(zhì)可及性、DNA甲基化或單細(xì)胞分辨率下染色質(zhì)可及位點(diǎn)的組蛋白修飾，如scDNase-seq、sci-ATAC seq、scATAC-seq、scMNase-seq、scChIP-seq等，可以檢測H3K4me3和H3K4me2修飾。

基于這些技術(shù)，開發(fā)了多種聯(lián)合檢測染色質(zhì)可及性和轉(zhuǎn)錄組的單細(xì)胞多組學(xué)高通量方法。Cao等人（2018）開發(fā)了sci-CAR，是第一個(gè)可以同時(shí)分析同一細(xì)胞中mRNA和ATAC的技術(shù)。Sci-CAR對每個(gè)細(xì)胞進(jìn)行組合索引，通過FACs分離細(xì)胞，裂解后進(jìn)行擴(kuò)增測序。Cao等人（2018）將sci-CAR技術(shù)應(yīng)用于人類和小鼠細(xì)胞系混合物以及小鼠腎組織，并從聯(lián)合分析數(shù)據(jù)集中確定了順式調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。然而，由于scATAC數(shù)據(jù)模式的高稀疏性和scRNA模式測序深度有限，在sci-CAR數(shù)據(jù)集中只能重現(xiàn)少數(shù)其他scRNA 和 scATAC 測序中的差異可及位點(diǎn)和差異表達(dá)基因。Chen等（2019d）開發(fā)了基于液滴的SNARE-seq（single-nucleus chromatin accessibility and mRNA expression sequencing），增強(qiáng)了scRNA和scATAC的測序覆蓋范圍，并改善了sci-CAR技術(shù)的覆蓋限制。SNARE-seq使用夾板寡核苷酸，其序列與 ATAC 轉(zhuǎn)座酶插入的接頭序列（5' 端）和 mRNA polyA序列互補(bǔ)，可以捕獲兩個(gè)組學(xué)數(shù)據(jù)。與 sci-CAR 相比，SNARE-seq 在小鼠腦數(shù)據(jù)集和成人腦數(shù)據(jù)集中檢測到的染色質(zhì)可及位點(diǎn)是 sciCAR 組織數(shù)據(jù)集的4-5倍，并通過細(xì)胞組合索引策略提高了檢測通量。Zhu等（2019b）進(jìn)一步完善了該方案，開發(fā)了Paired-seq，通過測序同時(shí)檢測單個(gè)細(xì)胞中的RNA表達(dá)和DNA可及性。其主要是采用基于連接的組合索引策略，通過 Tn5 轉(zhuǎn)座酶切割開放染色質(zhì)片段，通過RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA 分子。使用Paired-seq技術(shù)檢測小鼠胚胎大腦皮層組織，并與ENCODE小鼠胚胎大腦皮層組織數(shù)據(jù)集進(jìn)行整合分析，重建細(xì)胞軌跡，并從雙組學(xué)數(shù)據(jù)集中恢復(fù)了順式調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。Ma等人（2020）開發(fā)了SHARE-seq技術(shù)（simultaneous high-throughput ATAC and RNA expression with sequencing），該方法使用多輪雜交阻斷來聯(lián)合標(biāo)記同一單細(xì)胞中的mRNA和染色質(zhì)片段。與sciCAR、SNARE-seq和Paired-seq相比，SHARE-seq在超過30,000個(gè)細(xì)胞的更大文庫上具有更高的可擴(kuò)展性，并且在每個(gè)細(xì)胞中檢測到更多的基因和ATAC peak時(shí)具有更高的靈敏度。基于更高的數(shù)據(jù)質(zhì)量，Ma等人給出了一個(gè)新的計(jì)算策略DORCs（domains of regulatory chromatin，調(diào)控染色質(zhì)域），而不是單個(gè)峰來分析染色質(zhì)可及性和基因表達(dá)之間的調(diào)控圖譜，DORCs在細(xì)胞譜系選擇和細(xì)胞命運(yùn)決定中優(yōu)于基因表達(dá)，可以更好的預(yù)測細(xì)胞命運(yùn)。最近，10x Genomics 開發(fā)了10x Multiome，一個(gè)用于單細(xì)胞中scRNA和scATAC聯(lián)合檢測的商業(yè)服務(wù)平臺，這將加速scRNA和scATAC多組學(xué)技術(shù)在更多生物學(xué)和臨床研究中的應(yīng)用。

3. 轉(zhuǎn)錄組+蛋白組
除了針對DNA和RNA的單細(xì)胞多組學(xué)，還開發(fā)了多種可以同時(shí)測量同一細(xì)胞中RNA和蛋白質(zhì)的單細(xì)胞技術(shù)。PEA/STA技術(shù)（proximity extension assay/specific RNA target amplification）使用逆轉(zhuǎn)錄酶作為DNA聚合酶，用于RNA的反轉(zhuǎn)錄和38種蛋白PEA中DNA寡核苷酸的延伸，以使cDNA合成和PEA能夠同時(shí)在 Fluidigm C1 TM 系統(tǒng)中進(jìn)行。PLAYR（proximity ligation assay for RNA）技術(shù)是一種使用流式細(xì)胞術(shù)和質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行多重轉(zhuǎn)錄物定量的方法，與標(biāo)準(zhǔn)抗體染色兼容。PLAYR允許同時(shí)測量40多種mRNA和蛋白質(zhì)，并能夠在單細(xì)胞水平上表征轉(zhuǎn)錄和翻譯之間的相互作用。除了蛋白-RNA聯(lián)合檢測外，還開發(fā)了兩種靶向表面蛋白和mRNA的方法：CITE-seq和REAP-seq，這兩種技術(shù)使用寡核苷酸標(biāo)記的抗體檢測mRNA和細(xì)胞表面蛋白，并通過基于液滴的單細(xì)胞測序方法實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞水平的多組學(xué)分析，極大地提高了轉(zhuǎn)錄組的通量。例如，REAP-seq可以用82種抗體定量蛋白質(zhì)，并在一次實(shí)驗(yàn)中檢測超過20,000個(gè)基因。RAID（single-cell RNA and immunodetection）可以檢測細(xì)胞內(nèi)蛋白和磷酸化蛋白以及mRNA。RAID用連接RNA條形碼的抗體對細(xì)胞內(nèi)靶蛋白進(jìn)行免疫標(biāo)記，然后將蛋白轉(zhuǎn)化為RNA。

4. 捕獲兩種以上組學(xué)的技術(shù)
基于上面討論的方法，還開發(fā)了多種方法檢測同一個(gè)細(xì)胞中兩個(gè)以上的組學(xué)。scNMT-seq（Single-cell nucleosome, methylation and transcription sequencing）將scM&T-seq和NOMe-seq相結(jié)合，用于測量同一細(xì)胞中的核小體、轉(zhuǎn)錄組和DNA甲基化信息。scNOMeRe-seq，能夠在同一個(gè)細(xì)胞中分析全基因組染色質(zhì)可及性、DNA甲基化和轉(zhuǎn)錄組�；�于CITE-seq，開發(fā)了ECCITE-seq(Expanded CRISPR-compatible Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by sequencing)，可以同時(shí)檢測單細(xì)胞中的蛋白、轉(zhuǎn)錄組、克隆型和CRISPR信息。通過整合pair -seq與CUT&Tag技術(shù)，開發(fā)了Paired-Tag技術(shù)，可以同時(shí)分析同一細(xì)胞中scRNA，scATAC和五種組蛋白修飾。scCUT&Tag-pro技術(shù)，也是將CUT&Tag與CITE-seq結(jié)合，通過CUT&Tag文庫捕獲5個(gè)組蛋白修飾，通過抗體衍生蛋白標(biāo)簽文庫捕獲蛋白質(zhì)。

多組學(xué)整合分析
單細(xì)胞多組學(xué)技術(shù)的發(fā)展為多視角、多維度、高分辨率的揭示分子機(jī)制提供了豐富的數(shù)據(jù)資源。然而，由于數(shù)據(jù)維數(shù)高、數(shù)據(jù)稀疏度高以及多組學(xué)數(shù)據(jù)集和技術(shù)之間變量復(fù)雜等問題，難以對多組學(xué)數(shù)據(jù)集進(jìn)行正確的整合分析。目前越來越多的算法被開發(fā)出來，本文從以下兩個(gè)角度介紹了多組學(xué)整合分析算法和相關(guān)研究，包括（1）多組學(xué)整合工具的類別，其中介紹了最近發(fā)表的單細(xì)胞多組學(xué)整合工具，并按照不同的分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類；（2）最近發(fā)表的工具的基準(zhǔn)研究。

1. 多組學(xué)整合工具的分類
基于之前的綜述論文，可以應(yīng)用幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)對多組學(xué)整合工具進(jìn)行分類。首先，基于數(shù)據(jù)集的共同特征（稱為錨點(diǎn)）的選擇，多組學(xué)整合分析可以分為四種主要的整合策略，包括以所有基因組特征（如基因）為錨點(diǎn)的水平整合，以所有共同細(xì)胞為錨點(diǎn)的垂直整合，無共享特征的對角線整合以及以部分共享細(xì)胞和部分共享基因組特征為錨點(diǎn)的馬賽克整合。具有相似方法學(xué)的工具也可能被開發(fā)為不同類型。例如，對于基于非負(fù)矩陣分解 （NMF） 的算法，iNMF被設(shè)計(jì)為垂直整合工具，coupledNMF被設(shè)計(jì)為對角線整合工具，UINMF被設(shè)計(jì)為馬賽克整合工具。

其次，多組學(xué)整合工具也可以根據(jù)多組學(xué)技術(shù)的類型分類，包括“配對”和“非配對”整合工具。配對的多組學(xué)整合工具是專門為同時(shí)從同一細(xì)胞捕獲和測序的多組學(xué)數(shù)據(jù)集而設(shè)計(jì)的。配對整合工具通常采用垂直整合和鑲嵌整合策略，因?yàn)榕鋵��?shù)據(jù)集在不同組學(xué)之間共享全部或部分細(xì)胞。非配對整合工具旨在整合來自不同細(xì)胞的多種單細(xì)胞組學(xué)數(shù)據(jù)，因?yàn)橐环N組學(xué)的細(xì)胞無法從其他組學(xué)中找到匹配的細(xì)胞。由于細(xì)胞和基因的差異，對角線整合通常用于非成對數(shù)據(jù)整合。針對配對或非配對多組學(xué)數(shù)據(jù)集整合，開發(fā)了一些工具。例如，Seurat v3是為未配對的多組學(xué)數(shù)據(jù)集設(shè)計(jì)的，而更新版本Seurat v4是專門為配對的多組學(xué)數(shù)據(jù)集設(shè)計(jì)的。一些整合工具可以同時(shí)應(yīng)用于成對和非成對的多組學(xué)數(shù)據(jù)集。

第三，基于方法論，多組學(xué)整合工具可以分為：數(shù)學(xué)矩陣分解方法、流形對齊方法、基于網(wǎng)絡(luò)的方法和深度學(xué)習(xí)方法。深度學(xué)習(xí)整合工具可以根據(jù)深度模型的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)進(jìn)一步分類，包括自編碼器（AE）、生成對抗網(wǎng)絡(luò)（GAN）、GNN及其擴(kuò)展結(jié)構(gòu)，如變分自編碼器（VAE）。選擇哪種方法很大程度上取決于多組學(xué)數(shù)據(jù)集的類型和整合目的。對于未配對的多組學(xué)數(shù)據(jù)集，流形對齊方法可以首先將多組學(xué)數(shù)據(jù)集的不同特征降低到同一維度的潛在嵌入/流形中，然后通過相同的流形整合異構(gòu)組學(xué)。同樣，矩陣分解方法可以通過將不匹配的基因或細(xì)胞矩陣分解為相同維度的矩陣以應(yīng)用于不同的整合任務(wù)，與簡單的降維方法以及流形對齊相比，信息損失更少。使用GAN, VAE和transformer的深度學(xué)習(xí)工具可以從相同細(xì)胞或共享細(xì)胞的不同組學(xué)中學(xué)習(xí)到共同的潛在嵌入信息，然后填補(bǔ)缺失的細(xì)胞和基因，如GNN模型用于學(xué)習(xí)不同類型的特征（如scRNA中的基因和scATAC中的peak等）之間的關(guān)系，并推斷多組學(xué)數(shù)據(jù)中的生物網(wǎng)絡(luò)。

第四，根據(jù)特定的組學(xué)對多組學(xué)整合工具進(jìn)行分類。針對特定的多組學(xué)數(shù)據(jù)集整合，設(shè)計(jì)了一些多組學(xué)整合算法；例如，CiteFuse是為CITE-seq分析而設(shè)計(jì)的，SCIM是為scRNA和CyTOF整合而設(shè)計(jì)的，而scMVP是為配對的scRNA和scATAC數(shù)據(jù)集整合而開發(fā)的。此外，除了這些僅限于特定組學(xué)數(shù)據(jù)類型的工具外，還有一些算法，如LIGER是為一般性整合任務(wù)而設(shè)計(jì)的，不受整合組學(xué)類型的限制。

多組學(xué)整合工具還可以按Python、R等主要編碼語言以及跨組學(xué)翻譯等特殊整合應(yīng)用程序進(jìn)行分類。所有多組學(xué)整合工具及其類別總結(jié)在補(bǔ)充材料中。

2. 單細(xì)胞多組學(xué)整合工具的基準(zhǔn)研究
盡管針對多組學(xué)單細(xì)胞分析已經(jīng)發(fā)表了大量的整合算法，但仍然很難找到最優(yōu)解。為了解決這個(gè)問題，最近有多項(xiàng)基準(zhǔn)研究，試圖從數(shù)據(jù)用戶的角度對候選整合算法的性能進(jìn)行全面而客觀的評估。

Luecken等人（2022）對單細(xì)胞整合工具進(jìn)行了基準(zhǔn)分析，用于圖譜級數(shù)據(jù)整合任務(wù)，并開發(fā)了一個(gè)對單細(xì)胞整合工具進(jìn)行客觀、全面和可重復(fù)評估的基準(zhǔn)流程。該研究包括幾個(gè)未配對的多組學(xué)單細(xì)胞整合工具；然而，該研究只針對來自相同組學(xué)的不同數(shù)據(jù)集的整合任務(wù)，如不同scRNA數(shù)據(jù)集的整合或不同scATAC數(shù)據(jù)集的整合，而沒有提供評估配對或未配對的scRNA和scATAC數(shù)據(jù)的跨組學(xué)整合。盡管如此，本研究仍然為單細(xì)胞圖譜整合評估提供了一個(gè)穩(wěn)定、全面、高度可擴(kuò)展的基準(zhǔn)框架。

最近，為了更好地應(yīng)對單細(xì)胞多組學(xué)整合分析的數(shù)據(jù)稀疏性、技術(shù)和生物可變性以及高維度帶來的分析挑戰(zhàn)，NeuraIPS2021組織了關(guān)于整合單細(xì)胞多組學(xué)數(shù)據(jù)三個(gè)主要任務(wù)的在線競賽，包括（1）從一種組學(xué)預(yù)測另一種組學(xué)，（2）不同組學(xué)之間的細(xì)胞匹配，（3）共同學(xué)習(xí)細(xì)胞身份的表征。其中，第二項(xiàng)任務(wù)是針對非配對多組學(xué)整合工具設(shè)計(jì)的，第三項(xiàng)任務(wù)是針對配對多組學(xué)整合工具設(shè)計(jì)的。此外，競賽還生成了第一個(gè)單細(xì)胞多組學(xué)基準(zhǔn)數(shù)據(jù)集，包括一個(gè)CITE-seq數(shù)據(jù)集，其中包含90000個(gè)細(xì)胞，用于scRNA和蛋白質(zhì)整合任務(wù)，以及一個(gè)10x Multiome數(shù)據(jù)集，包含70000個(gè)細(xì)胞，用于scRNA和scATAC整合任務(wù)。在三個(gè)任務(wù)中，GLUE包中的半監(jiān)督模式匹配函數(shù)CLUE（cross-linked universal embedding）算法在第二個(gè)組學(xué)匹配任務(wù)中獲得一等獎(jiǎng)并獲得所有類別的冠軍，顯示了在未配對整合工具中交叉組學(xué)匹配的最佳性能。然而，由于競賽只評估在線提交者的算法，大多數(shù)已發(fā)表的單細(xì)胞多組學(xué)整合工具不在評估范圍內(nèi)。

為了進(jìn)一步比較已發(fā)表的單細(xì)胞多組學(xué)整合工具與深度學(xué)習(xí)框架，Brombacher等人（2022）首先使用深度學(xué)習(xí)模型回顧了18個(gè)最近發(fā)表的多組學(xué)整合工具，然后使用來自NeuraIPS2021的CITE-seq數(shù)據(jù)集和10x Multiome數(shù)據(jù)集對選定的工具進(jìn)行了第一次全面的基準(zhǔn)研究。在生物特征保存任務(wù)中，Cobolt算法在CITE-seq和10x Multiome數(shù)據(jù)集上的性能都是基準(zhǔn)算法中最好的。只有當(dāng)細(xì)胞數(shù)較大時(shí)，scMVP在10x Multiome數(shù)據(jù)集上的性能優(yōu)于Cobolt。技術(shù)影響去除任務(wù)中，SCALEX在CITE-seq數(shù)據(jù)集上表現(xiàn)出的最佳性能，而scMVP在10x Multiome數(shù)據(jù)集上表現(xiàn)出最佳性能。

總結(jié)
在本章中，作者總結(jié)了多種類型的多組學(xué)單細(xì)胞測序技術(shù)及生物信息學(xué)整合算法的最新進(jìn)展。隨著實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)質(zhì)量和生物信息學(xué)算法性能的提升，單細(xì)胞多組學(xué)技術(shù)將在單細(xì)胞水平上為不同研究提供更全面的多組學(xué)見解。擴(kuò)大單細(xì)胞多組學(xué)技術(shù)的生物應(yīng)用，提高單細(xì)胞多組學(xué)算法的性能，都將加速生物和醫(yī)學(xué)研究的新發(fā)現(xiàn)。這些改進(jìn)具有重大的潛力，將徹底改變我們對細(xì)胞進(jìn)程的理解和個(gè)性化醫(yī)療的發(fā)展。

參考文獻(xiàn)：
Sun F, Li H, Sun D, et al. Single-cell omics: experimental workflow, data analyses and applications. Sci China Life Sci. 2025;68(1):5-102. doi:10.1007/s11427-023-2561-0