Cir Res丨糖尿病時(shí)單核細(xì)胞分泌pro-CTSD誘發(fā)血腦轉(zhuǎn)胞吞作用

2型糖尿病是全球范圍內(nèi)日益嚴(yán)重的健康問(wèn)題，血管并發(fā)癥是糖尿病致死和致殘的主要原因。關(guān)于糖尿病腦血管的研究，既往一直聚焦在頭頸大血管動(dòng)脈硬化和血管狹窄方面。近年來(lái)隨著影像技術(shù)的發(fā)展糖尿病腦微血管病變逐漸受到關(guān)注。糖尿病微血管病變與中風(fēng)、認(rèn)知障礙、癡呆、抑郁、腦淀粉樣變以及脫髓鞘等多種疾病相關(guān)。關(guān)于腦微血管疾病的發(fā)病機(jī)制主要包括血腦屏障功能障礙、腦微血管血流調(diào)節(jié)減退以及炎癥因子誘發(fā)炎癥反應(yīng)等，但2型糖尿病腦微血管病變的確切機(jī)制尚不明確。單核細(xì)胞是血液存在的最大的單個(gè)核白細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)糖尿病模式小鼠循環(huán)血單核細(xì)胞明顯增加。并且發(fā)現(xiàn)糖尿病時(shí)單核細(xì)胞可以穿過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞到達(dá)血管壁下，在此分化為局部巨噬細(xì)胞并吞噬低密度脂蛋白形成泡沫細(xì)胞，這是糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化的核心病理生理過(guò)程。此外，還發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞可以通過(guò)信號(hào)調(diào)節(jié)影響血管發(fā)芽和血管生成等過(guò)程。然而，單核細(xì)胞與內(nèi)皮相互作用是否參與以及如何參與糖尿病腦微血管病變至今仍不清楚。

 

趙偉東教授領(lǐng)導(dǎo)的課題組通過(guò)高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者循環(huán)血單核細(xì)胞組織蛋白酶D（CTSD）表達(dá)升高，并發(fā)現(xiàn)糖尿病微血管并發(fā)癥時(shí)單核細(xì)胞CTSD的表達(dá)水平進(jìn)一步升高。由此，課題組構(gòu)建了單核細(xì)胞表達(dá)人源CTSD的轉(zhuǎn)基因小鼠，并發(fā)現(xiàn)該小鼠出現(xiàn)了腦微血管通透性增加以及認(rèn)知缺陷的表型，該表型與糖尿病微血管病變類似。機(jī)制方面，趙偉東教授課題組首次發(fā)現(xiàn)糖尿病時(shí)循環(huán)血單核細(xì)胞釋放非酶形式的pro-CTSD與腦血管內(nèi)皮細(xì)胞表面低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1（LRP1）相結(jié)合，上調(diào)小窩蛋白表達(dá)并激活腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中小窩蛋白介導(dǎo)的轉(zhuǎn)胞吞作用，進(jìn)而導(dǎo)致腦微血管滲漏。在此過(guò)程中，血腦屏障經(jīng)典的細(xì)胞旁通路并未參與。更重要的是，課題組發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞CTSD基因的敲除對(duì)糖尿病腦微血管滲漏和認(rèn)知障礙具有保護(hù)作用，并由此提出了治療2型糖尿病腦微血管病變的新的治療策略。

 

該研究發(fā)表于美國(guó)心臟協(xié)會(huì)主辦的心腦血管基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的國(guó)際期刊《循環(huán)研究》（Circulation Research，中科院一區(qū)，最新影響因子20.1），論文的第一作者是中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科趙丹，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院趙偉東教授為該論文的通訊作者。第一作者單位為中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，通訊作者單位為中國(guó)醫(yī)科大學(xué)。

 

研究材料

在該研究中，研究人員構(gòu)建了單核細(xì)胞表達(dá)人源CTSD的轉(zhuǎn)基因小鼠（hCTSDhi）以及CTSD單核細(xì)胞特異性敲除的轉(zhuǎn)基因小鼠（CTSDmKO）（兩種小模型均由賽業(yè)生物提供）。體外研究才用了高表達(dá)CTSD的THP-1細(xì)胞和人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞。

 

技術(shù)方法

研究中采用了包括全外顯子組測(cè)序分析、q-PCR、實(shí)時(shí)雙光子活體成像、組織切片免疫熒光染色共聚焦成像、新物體識(shí)別和Y迷宮實(shí)驗(yàn)、電鏡成像等技術(shù)。在分子機(jī)制研究時(shí)他們使用了單細(xì)胞測(cè)序、質(zhì)譜分析、Western blotting、體外血腦屏障模型等實(shí)驗(yàn)技術(shù)。

 

技術(shù)路線

 

 

研究結(jié)果

1. 2型糖尿病患者循環(huán)血單核細(xì)胞中CTSD表達(dá)上調(diào)
 

為了評(píng)估型糖尿病患者（T2DM）循環(huán)血單核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄變化，研究者從糖尿病患者年齡匹配的健康志愿者血液中分離單核細(xì)胞。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)糖尿病患者循環(huán)單核細(xì)胞CTSD（組織蛋白酶D）表達(dá)升高。CTSD一種普遍分布的溶酶體天冬氨酸蛋白酶，其前提pro-CTSD具有可分泌性。為了明確CTSD與糖尿病微血管并發(fā)癥的相關(guān)性，研究者進(jìn)一步從T2DM微血管并發(fā)癥患者血液中分離出單核細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)與無(wú)微血管并發(fā)癥的糖尿病患者相比，微血管并發(fā)癥的糖尿病患者的單核細(xì)胞中CTSD表達(dá)進(jìn)一步升高。而且發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞CTSD表達(dá)水平與患者的空腹血糖以及糖化血紅蛋白水平呈正相關(guān)。

 

 

圖1. 糖尿病患者單核細(xì)胞CTSD表達(dá)增加

 

2. hCTSDhi轉(zhuǎn)基因小鼠腦微血管通透性增加

 

為了探討單核細(xì)胞CTSD上調(diào)對(duì)腦微血管的影響，研究者利用構(gòu)建了單核細(xì)胞表達(dá)人源CTSD的轉(zhuǎn)基因小鼠，命名為hCTSDhi(圖2A)。用CD31抗體對(duì)腦切片進(jìn)行免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)hCTSDhi小鼠腦微血管的密度和形態(tài)無(wú)明顯變化(圖2C)。研究者進(jìn)一步通過(guò)實(shí)時(shí)的雙光子活體成像實(shí)驗(yàn)評(píng)估小鼠腦微血管的血腦屏障的功能。在靜脈注射熒光示蹤劑后FITC-dextran后，研究者發(fā)現(xiàn)hCTSDhi小鼠的腦組織中可以觀察到在血管外示蹤劑進(jìn)行性積累的現(xiàn)象(圖2D)，這表明hCTSDhi小鼠的腦血管對(duì)熒光示蹤劑滲漏。NeuN抗體免疫染色發(fā)現(xiàn)hCTSDhi小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元密度顯著下降(圖2I)。同時(shí)，新物體識(shí)別測(cè)試結(jié)果顯示hCTSDhi小鼠對(duì)新物體的探索減少(圖2J)， Y迷宮實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)hCTSDhi小鼠在獲得食物獎(jiǎng)勵(lì)的正確臂內(nèi)的停留的時(shí)間下降(圖2K)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明hCTSDhi小鼠存在認(rèn)知記憶障礙。這些結(jié)果表明，單核細(xì)胞CTSD的高表達(dá)引起腦腦血管滲漏從而損傷神經(jīng)元，導(dǎo)致認(rèn)知記憶功能障礙。

 

 

圖2. hCTSDhi小鼠腦微血管通透性增加

 

3. hCTSDhi小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞囊泡介導(dǎo)的轉(zhuǎn)胞吞增強(qiáng)

 

血管周細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞端足對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的覆蓋對(duì)血腦屏障的維持至關(guān)重要。因此，通過(guò)CD31和CD13(周細(xì)胞標(biāo)記物)或AQP4(星形細(xì)胞端足標(biāo)記物)的免疫染色來(lái)分析周細(xì)胞和星形細(xì)胞端足的血管內(nèi)皮細(xì)胞的覆蓋率。結(jié)果顯示，hCTSDhi小鼠腦周細(xì)胞(圖3A)和星形細(xì)胞端足(圖3B)的血管覆蓋率保持不變，提示hCTSDhi小鼠腦微血管的通透性增高是由于腦內(nèi)皮細(xì)胞本身變化導(dǎo)致的。對(duì)小鼠腦組織進(jìn)行進(jìn)行透射電子顯微鏡(TEM)成像，發(fā)現(xiàn)hCTSDhi小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中的囊泡顯著增加(圖3E)而緊密連接結(jié)構(gòu)無(wú)損傷，這提示該小鼠腦微血管滲漏是內(nèi)皮細(xì)胞中囊泡介導(dǎo)的胞吞增強(qiáng)所致。為了驗(yàn)證該猜想，研究者進(jìn)一步進(jìn)行了示蹤的電鏡成像，在靜脈注射了電鏡示蹤劑HRP后收集小鼠腦組織進(jìn)行電鏡成像，結(jié)果發(fā)現(xiàn)hCTSDhi小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中HRP陽(yáng)性的囊泡顯著增減，然而腦血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接結(jié)構(gòu)這并未見(jiàn)到HRP示蹤劑分布。該結(jié)果說(shuō)明，單核細(xì)胞CTSD的高表達(dá)增強(qiáng)了腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中囊泡介導(dǎo)的轉(zhuǎn)胞吞作用，而不影響血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接的完整性。

 

 

圖3. hCTSDhi小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中囊泡介導(dǎo)的轉(zhuǎn)胞吞作用增強(qiáng)

 

4. 腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中Cav1上調(diào)導(dǎo)致hCTSDhi小鼠腦血管滲漏

 

為了探討hCTSDhi小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞囊泡介導(dǎo)的轉(zhuǎn)胞吞增強(qiáng)的分子機(jī)制，研究者進(jìn)行hCTSDhi小鼠腦組織單細(xì)胞RNA測(cè)序分析。細(xì)胞聚類分析顯示，hCTSDhi小鼠腦內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞百分比略有變化(圖4A)。對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞簇進(jìn)行差異基因分析，分析hCTSDhi小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)29個(gè)上調(diào)基因和33個(gè)下調(diào)基因(圖4B)�；�因集富集分析顯示，差異表達(dá)基因在內(nèi)吞途徑(頂部，圖4C)和小窩途徑(底部，圖4C)中顯著富集。在hCTSDhi小鼠腦內(nèi)皮細(xì)胞的差異表達(dá)基因中，發(fā)現(xiàn)小窩主要結(jié)構(gòu)成分Cav1 (caveolin 1)和Cavin2 (caveolae-associated protein 2)上調(diào)，圖4D)。細(xì)胞群分析顯示，與野生型對(duì)照相比，hCTSDhi小鼠的Cav1+內(nèi)皮細(xì)胞增加的比例高于Cavin2+內(nèi)皮細(xì)胞增加的比例 (圖4E)。內(nèi)皮細(xì)胞群進(jìn)一步分為靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(上圖，圖4F)，發(fā)現(xiàn)Cav1在hCTSDhi小鼠的3個(gè)內(nèi)皮亞群中均有升高，其中在毛細(xì)血管細(xì)胞中升高的比例尤其高(相比野生型小鼠，圖4F)。進(jìn)一步對(duì)腦切片進(jìn)行免疫染色，結(jié)果證實(shí)了hCTSDhi小鼠腦微血管中Cav1的表達(dá)增加(圖4G)。為了驗(yàn)證Cav1的上調(diào)導(dǎo)致hCTSDhi小鼠腦血管通透性升高，研究者用編碼shRNA-Cav1的AAV-BR1病毒特異性干擾內(nèi)皮細(xì)胞Cav1，然后進(jìn)行血管通透性分析。發(fā)現(xiàn)下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞Cav1后，hCTSDhi小鼠腦實(shí)質(zhì)纖維蛋白原沉積和熒光葡聚糖滲漏的現(xiàn)象明顯緩解了 (圖4H和4I)。進(jìn)一步的TEM分析顯示，hCTSDhi小鼠腦內(nèi)皮中囊泡的積聚的現(xiàn)象也減輕了。 (圖4J)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，外周單核細(xì)胞CTSD的上調(diào)增加了腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞Cav1，促進(jìn)了囊泡介導(dǎo)的血腦轉(zhuǎn)胞吞作用，導(dǎo)致腦微血管通透性增加。

 

圖4. hCTSDhi小鼠腦內(nèi)皮中Cav1上調(diào)導(dǎo)致胞吞作用增強(qiáng)

 

5. 單核細(xì)胞分泌Pro-CTSD觸發(fā)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞Cav1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)胞吞作用

 

高表達(dá)CTSD的單核細(xì)胞是如何調(diào)節(jié)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)胞吞作用？研究者假設(shè)CTSD具有可分泌性，可以由單核細(xì)胞分泌到血漿中，然后對(duì)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生作用。因此，作者對(duì)T2DM患者的血漿樣本進(jìn)行了Western blot分析。發(fā)現(xiàn)血漿中的CTSD主要以53 kD的pro-CTSD形式存在，T2DM患者血漿中pro-CTSD的含量顯著升高(圖5A)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)hCTSDhi小鼠血漿中也存在高水平的人源pro-CTSD (圖5C和5D)。研究者使用濃度梯度葡萄糖處理的單核細(xì)胞系THP-1，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞上清中pro-CTSD的水平表現(xiàn)出葡萄糖濃度依賴性，而具有酶活性的CTSD（CTSD重鏈）的含量卻無(wú)明顯變化 (圖5E)。這些數(shù)據(jù)表明高糖誘發(fā)單核細(xì)胞過(guò)度分泌pro-CTSD。接下來(lái)研究者利用慢病毒構(gòu)建了一個(gè)穩(wěn)定的過(guò)表達(dá)CTSD的單核THP-1細(xì)胞系(命名為CTSDOE)，利用該細(xì)胞分泌的細(xì)胞上清CTSDOE CM評(píng)估分泌的pro-CTSD對(duì)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)分泌的pro-CTSD上調(diào)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞Cav1的表達(dá)，增加內(nèi)皮細(xì)胞屏障的通透性。接著研究者又通過(guò)qRT-PCR和Luciferas實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，pro-CTSD是在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞Cav1蛋白（小凹蛋白）的表達(dá)的。

 

 

圖5. 糖尿病單核細(xì)胞分泌pro-CTSD上調(diào)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中的Cav1的表達(dá)并促進(jìn)轉(zhuǎn)胞吞作用。

 

6. 分泌的pro-CTSD結(jié)合腦血管內(nèi)皮細(xì)胞LRP1受體激活NF-kB信號(hào)并上調(diào)Cav1表達(dá)增強(qiáng)轉(zhuǎn)胞吞作用

 

研究者利用質(zhì)譜分析的方法篩選分布于腦血管內(nèi)皮細(xì)胞表面且可以與pro-CTSD結(jié)合的受體蛋白（圖6A），結(jié)果發(fā)現(xiàn)低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1（LRP1）可以與pro-CTSD相互作用（圖6B）。并進(jìn)一步通過(guò)免疫沉淀和Pulldown實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)pro-CTSD主要與LRP1的α亞基的細(xì)胞外簇2結(jié)合(圖6C)。為了明確pro-CTSD與LRP1結(jié)合對(duì)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞Cav1的上調(diào)作用，研究者利用干擾技術(shù)抑制了腦血管內(nèi)皮細(xì)胞LRP1的表達(dá)，Western blot結(jié)果顯示腦血管內(nèi)皮細(xì)胞LRP1的抑制可以有效阻斷抑CTSDOE CM對(duì)的Cav1的上調(diào)作用(圖6D)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)類似的效果，利用AAV-BR1病毒特異性沉默腦血管內(nèi)皮細(xì)胞LRP1可以有效阻斷hCTSDhi小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中Cav1的高表達(dá) (圖6G)。同時(shí)TEM分析顯示，干擾LRP1可以明顯緩解 hCTSDhi小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞囊泡增多的現(xiàn)象 (圖6H)。這些數(shù)據(jù)表明，pro-CTSD與腦內(nèi)皮細(xì)胞LRP1受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域2簇結(jié)合，促進(jìn)Cav1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)胞吞作用。接著，研究者又對(duì)pro-CTSD與LRP1結(jié)合激活的下游信號(hào)通路進(jìn)行探討，發(fā)現(xiàn)pro-CTSD與LRP1的結(jié)合可以激活腦內(nèi)皮細(xì)胞NF-kB轉(zhuǎn)錄信號(hào)通路，上調(diào)Cav1的表達(dá)，增強(qiáng)Cav1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)胞吞作用（圖6I-K）。

 

 

 

圖6. 分泌的pro-CTSD與LRP1受體細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域2結(jié)合，激活內(nèi)皮細(xì)胞NF-kb信號(hào)通路上調(diào)Cav1表達(dá)，增強(qiáng)囊泡介導(dǎo)的轉(zhuǎn)胞吞作用

 

7. 敲出單核細(xì)胞CTSD可以緩解糖尿病小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)胞吞增強(qiáng)，對(duì)糖尿病認(rèn)知功能損傷具有保護(hù)作用

 

接下來(lái)，研究者利用LoxP-Cre技術(shù)單倍敲除了小鼠單核細(xì)胞中的CTSD（構(gòu)建CTSDmKO小鼠），探討CTSD的下調(diào)是否對(duì)糖尿病相關(guān)的腦微血管損傷具有保護(hù)作用。通過(guò)qRT-PCR和ELISA檢測(cè)可見(jiàn)，CTSD的單倍敲降可以有效的將糖尿病模型小鼠單核細(xì)胞中和血漿中的CTSD水平控制在健康對(duì)照小鼠的水平(圖7B和7C)。接著研究者又使用FITC-葡聚糖(40 kDa)進(jìn)行了體內(nèi)雙光子腦成像，評(píng)估CTSD消除后糖尿病小鼠腦微血管的損傷情況。發(fā)現(xiàn)CTSDfl/fl對(duì)照糖尿病小鼠的血管周FITC-葡聚糖外滲明顯，而糖尿病CTSDmKO小鼠的腦實(shí)質(zhì)中這種外滲明顯減少(圖7D)。并且發(fā)現(xiàn)CTSD敲除也可以有效緩解糖尿病小鼠視網(wǎng)膜血管中FITC-葡聚糖的滲漏(圖7E)。透射電鏡分析顯示，糖尿病CTSDmKO小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中囊泡的密度較糖尿病CTSDfl/fl小鼠也明顯下降(圖7F)，這說(shuō)明CTSD的敲出有效緩解了糖尿病誘發(fā)的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)胞吞增強(qiáng)的效應(yīng)。接著，研究者用NeuN抗體對(duì)腦片進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果顯示糖尿病CTSDmKO小鼠海馬神經(jīng)元的丟失有所減輕(圖7G)。Y迷宮和新物體識(shí)別測(cè)試結(jié)果顯示，糖尿病CTSDmKO小鼠的記憶和認(rèn)知能力恢復(fù)顯著 (圖7H和7I)。這些結(jié)果表明，單核細(xì)胞CTSD的敲出可以有效治療糖尿病誘發(fā)的腦微血管滲漏并可以緩解糖尿病導(dǎo)致的認(rèn)知障礙。

 

 

 

 

圖7. 敲除單核細(xì)胞CTSD可以有效緩解糖尿病小鼠的腦血管滲漏、改善認(rèn)知功能

 

研究結(jié)論

總之，該研究發(fā)現(xiàn)糖尿病時(shí)血環(huán)血單核細(xì)胞CTSD表達(dá)升高。單核細(xì)胞分泌pro-CTSD與腦血管內(nèi)皮細(xì)胞LRP1受體的胞外結(jié)構(gòu)域2結(jié)合，激活NF-kB信號(hào)通路，促進(jìn)Cav1的表達(dá)并增強(qiáng)Cav1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)胞吞作用，最終導(dǎo)致腦微血管滲漏并損傷認(rèn)知記憶能力。該研究為糖尿病腦微血管疾病提供了新的治療靶點(diǎn)和策略。

 

 

原文檢索

Zhao D, Huang Z-K, Liang Y, Li Z-J, Zhang X-W, Li K-H, Wu H, Zhang X-D, Li C-S, An D, et al. Monocytes release pro-cathepsin d to drive blood-to-brain transcytosis in diabetes. Circulation research. 2024;134:e17-e33