組織塊培養(yǎng)法提取原代細(xì)胞的步驟介紹
組織塊培養(yǎng)法：
1.提取組織：這一步，如果是動(dòng)物的組織，并不是所有的實(shí)驗(yàn)室都可以把小鼠拿到生物安全柜進(jìn)行解剖的，所以如果是在生物安全柜外的地方提取組織，那就注意以下幾點(diǎn)：
I.準(zhǔn)備冰盒，5%雙抗的PBS，培養(yǎng)皿。將培養(yǎng)皿盛適量5%雙抗的PBS，置于冰上
II.確認(rèn)目標(biāo)組織的位置和大小，精確分離。如果這點(diǎn)都錯(cuò)了，那提出來的細(xì)胞也并非你所要的細(xì)胞了，一切努力就白費(fèi)了。所以務(wù)必保證自己分離的組織是對(duì)的。盡量去除多余的組織，以保證細(xì)胞純度。
III.解剖所用的器械提前進(jìn)行高壓滅菌，減少污染可能。
2.沖洗組織：用冰盒將提取的組織轉(zhuǎn)移至生物安全柜或超凈臺(tái)，如果需要用到器械，那就要用另一套經(jīng)高壓滅菌的器械，和上面提取組織的器械分開，用5%雙抗的PBS快速?zèng)_洗3遍，這里的沖洗要注意，用巴氏管或1ml移液槍，對(duì)著組織吹打才叫沖洗。
3.剪碎組織：大小為1mm3，這一步也不可小覷，組織太大，不容易黏附在皿或瓶中。在20%或10%FBS的培養(yǎng)基中進(jìn)行。
4.平鋪組織：將組織平鋪于6孔板或培養(yǎng)皿中，這時(shí)候protocal就說，加入少量培養(yǎng)基，浸沒組織，但又不能使組織漂浮。這里有個(gè)小技巧，有些教程會(huì)說到，加入培養(yǎng)基后，傾斜培養(yǎng)瓶，這個(gè)是可以使組織貼于瓶或皿中的，傾斜多久呢？我覺得1-4h左右就可以，然后緩慢，一定要緩慢放平，使培養(yǎng)基緩慢浸沒組織，然后再重新放入培養(yǎng)箱中。我是用6孔板鋪的組織，然后加入300-400ul培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中4h后，緩慢！再加入500ul培養(yǎng)基。我覺得這個(gè)要做幾次，自己多感受一下，才能把握住量。
5.等待：我拿到的protocal是說48h后細(xì)胞會(huì)緩慢長(zhǎng)出，但是這里勸告大家，protocal畢竟是protocal，并不適用于每個(gè)人，我做了幾次48h后發(fā)現(xiàn)沒有細(xì)胞長(zhǎng)出就丟了，現(xiàn)在想想真是追悔莫及，不過也算是學(xué)習(xí)了。我的組織，等到了72h甚至96h后，組織周圍！這里又讓我這個(gè)實(shí)驗(yàn)小白吃了虧，沒人教，誤以為是組織塊以外的地方才能看見細(xì)胞，但是組織塊培養(yǎng)法就是細(xì)胞從組織中爬出來的，所以觀察組織塊及周圍，才能看見細(xì)胞。至于其他地方的一些黑點(diǎn)，估計(jì)是組織碎片，只要不是污染，就無需在意。所以組織塊培養(yǎng)法，大家要耐心等待，細(xì)胞長(zhǎng)出少許也不要急著丟棄組織，可以等細(xì)胞再多一些，但是如果組織塊已經(jīng)漂浮起來了，那就可以丟棄了。
6.換液和傳代：觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)，長(zhǎng)至80%左右進(jìn)行傳代培養(yǎng)，消化時(shí)間不要過長(zhǎng)，容易損傷細(xì)胞。
1.提取組織：這一步，如果是動(dòng)物的組織，并不是所有的實(shí)驗(yàn)室都可以把小鼠拿到生物安全柜進(jìn)行解剖的，所以如果是在生物安全柜外的地方提取組織，那就注意以下幾點(diǎn)：
I.準(zhǔn)備冰盒，5%雙抗的PBS，培養(yǎng)皿。將培養(yǎng)皿盛適量5%雙抗的PBS，置于冰上
II.確認(rèn)目標(biāo)組織的位置和大小，精確分離。如果這點(diǎn)都錯(cuò)了，那提出來的細(xì)胞也并非你所要的細(xì)胞了，一切努力就白費(fèi)了。所以務(wù)必保證自己分離的組織是對(duì)的。盡量去除多余的組織，以保證細(xì)胞純度。
III.解剖所用的器械提前進(jìn)行高壓滅菌，減少污染可能。
2.沖洗組織：用冰盒將提取的組織轉(zhuǎn)移至生物安全柜或超凈臺(tái)，如果需要用到器械，那就要用另一套經(jīng)高壓滅菌的器械，和上面提取組織的器械分開，用5%雙抗的PBS快速?zèng)_洗3遍，這里的沖洗要注意，用巴氏管或1ml移液槍，對(duì)著組織吹打才叫沖洗。
3.剪碎組織：大小為1mm3，這一步也不可小覷，組織太大，不容易黏附在皿或瓶中。在20%或10%FBS的培養(yǎng)基中進(jìn)行。
4.平鋪組織：將組織平鋪于6孔板或培養(yǎng)皿中，這時(shí)候protocal就說，加入少量培養(yǎng)基，浸沒組織，但又不能使組織漂浮。這里有個(gè)小技巧，有些教程會(huì)說到，加入培養(yǎng)基后，傾斜培養(yǎng)瓶，這個(gè)是可以使組織貼于瓶或皿中的，傾斜多久呢？我覺得1-4h左右就可以，然后緩慢，一定要緩慢放平，使培養(yǎng)基緩慢浸沒組織，然后再重新放入培養(yǎng)箱中。我是用6孔板鋪的組織，然后加入300-400ul培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中4h后，緩慢！再加入500ul培養(yǎng)基。我覺得這個(gè)要做幾次，自己多感受一下，才能把握住量。
5.等待：我拿到的protocal是說48h后細(xì)胞會(huì)緩慢長(zhǎng)出，但是這里勸告大家，protocal畢竟是protocal，并不適用于每個(gè)人，我做了幾次48h后發(fā)現(xiàn)沒有細(xì)胞長(zhǎng)出就丟了，現(xiàn)在想想真是追悔莫及，不過也算是學(xué)習(xí)了。我的組織，等到了72h甚至96h后，組織周圍！這里又讓我這個(gè)實(shí)驗(yàn)小白吃了虧，沒人教，誤以為是組織塊以外的地方才能看見細(xì)胞，但是組織塊培養(yǎng)法就是細(xì)胞從組織中爬出來的，所以觀察組織塊及周圍，才能看見細(xì)胞。至于其他地方的一些黑點(diǎn)，估計(jì)是組織碎片，只要不是污染，就無需在意。所以組織塊培養(yǎng)法，大家要耐心等待，細(xì)胞長(zhǎng)出少許也不要急著丟棄組織，可以等細(xì)胞再多一些，但是如果組織塊已經(jīng)漂浮起來了，那就可以丟棄了。
6.換液和傳代：觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)，長(zhǎng)至80%左右進(jìn)行傳代培養(yǎng)，消化時(shí)間不要過長(zhǎng)，容易損傷細(xì)胞。
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