免疫細(xì)胞培養(yǎng)通關(guān)技巧之質(zhì)量?jī)?yōu)化：支原體和內(nèi)毒素的檢測(cè)

免疫細(xì)胞培養(yǎng)的六個(gè)基本流程：樣本制備、細(xì)胞分選、分型鑒定、擴(kuò)增&培養(yǎng)、質(zhì)量?jī)?yōu)化、后續(xù)研究。今天我們繼續(xù)一起學(xué)習(xí)質(zhì)量?jī)?yōu)化的相關(guān)知識(shí)。
 

質(zhì)量?jī)?yōu)化（Quality Optimization）：針對(duì)一些不良因素，如樣本制備成單細(xì)胞懸液時(shí)產(chǎn)生的細(xì)胞團(tuán)塊、碎片等；細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)時(shí)支原體和內(nèi)毒素的影響，并積極采取對(duì)應(yīng)的措施。
 

1.單細(xì)胞懸液質(zhì)量?jī)?yōu)化：這部分的內(nèi)容大家可以參考《單細(xì)胞懸液制備方法及質(zhì)量?jī)?yōu)化方案 》進(jìn)行學(xué)習(xí)。

2.細(xì)胞培養(yǎng)質(zhì)量?jī)?yōu)化：在細(xì)胞培養(yǎng)過程，我們需要不定期進(jìn)行支原體和內(nèi)毒素的檢測(cè)，如果不慎“中招”，可以做到及時(shí)止損。

 

支原體 (Mycoplasma) 是介于細(xì)菌和病毒之間，沒有細(xì)胞壁的原核細(xì)胞型微生物。

 

（1）形態(tài)特征

支原體的體積很小，0.1-0.3 μm，光學(xué)顯微鏡無(wú)法觀測(cè)，也無(wú)法通過0.22μm的過濾器過濾，并且傳統(tǒng)的抗生素對(duì)支原體一般沒有效果。支原體可寄生/共生/獨(dú)立存活于培養(yǎng)基中，98%吸附于細(xì)胞膜或者細(xì)胞間隙。

 

（2）污染源

①支原體陽(yáng)性細(xì)胞的交叉污染，并且由于支原體可垂直傳染，一旦細(xì)胞發(fā)生污染，下一代細(xì)胞同樣也會(huì)存在支原體的污染；

②實(shí)驗(yàn)操作人員的口腔、唾液等等，實(shí)驗(yàn)人員的操作習(xí)慣，如交叉使用培養(yǎng)液、防護(hù)不到位也會(huì)成為支原體的污染來源；

③培養(yǎng)條件如操作環(huán)境、培養(yǎng)用的儀器耗材清潔或滅菌不到位也都會(huì)增加支原體污染的風(fēng)險(xiǎn)。

 

（3）對(duì)細(xì)胞研究的影響

①抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝，引起死亡：一般情況下輕度的支原體污染對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)沒有明顯的影響，但是由于消耗培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)，所以細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)變慢，支原體也可能通過感染細(xì)胞并利用其生物合成機(jī)制，抑制關(guān)鍵代謝途徑，最終導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)受阻和死亡[1]；

②染色體畸變，破壞核酸合成，DNA片段化：支原體可能通過與細(xì)胞核酸相互作用，引發(fā)染色體結(jié)構(gòu)的變異，影響DNA合成和維持染色體完整性，如支原體感染可以模擬shRNA介導(dǎo)的p53敲除，允許Ras轉(zhuǎn)化，從而使p53的功能失活[2]；

③改變細(xì)胞膜抗原性：支原體影響參與炎癥和細(xì)胞轉(zhuǎn)化的細(xì)胞途徑，如支原體的蛋白質(zhì)與TLR相互作用或進(jìn)入細(xì)胞，從而改變負(fù)責(zé)炎癥和DNA修復(fù)的幾種途徑[3]；

④改變轉(zhuǎn)染效率：支原體可能通過影響細(xì)胞內(nèi)的基因轉(zhuǎn)運(yùn)和表達(dá)機(jī)制，減緩或干擾DNA的轉(zhuǎn)染效率[4]；

⑤對(duì)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑敏感性增加：支原體可以通過某些蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡途徑中的關(guān)鍵分子，增加細(xì)胞對(duì)凋亡誘導(dǎo)劑的敏感性，如NAE和支原體酶MGA-0676的相互作用，誘導(dǎo)的DF-1細(xì)胞凋亡[5]。

 

（4）支原體的預(yù)防：

支原體的污染防治也是很重要的，比如：日常1-2周進(jìn)行支原體的檢測(cè)，對(duì)于新到的細(xì)胞株、凍存保種前、重要實(shí)驗(yàn)開始前都應(yīng)當(dāng)進(jìn)行支原體的檢測(cè)。10個(gè)預(yù)防支原體的tips大家可以保存學(xué)習(xí)噢（圖1）。
 

圖1 預(yù)防支原體污染的10個(gè)技巧

 

（5）支原體的檢測(cè)方法：支原體的檢測(cè)方法也非常多，小優(yōu)也給大家整理了每種方法的原理、優(yōu)缺點(diǎn)（表2）。

 

表2 支原體檢測(cè)方法的比較

 

（6）支原體的去除：目前最有效的支原體的清除方法是使用支原體清除劑，其他的方法比如清洗純化法（利用離心力、細(xì)胞、微生物質(zhì)量和懸液的浮力差達(dá)到清除支原體的目的）或者使用支原體特異血清也可以嘗試。

 

內(nèi)毒素（endotoxin）是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的一種成分，其化學(xué)本質(zhì)是一種脂多糖（LPS），其單位為Eu/mg或Eu/U。一個(gè)EU相當(dāng)于約0.1至0.2 ng內(nèi)毒素/mL溶液。內(nèi)毒素只有當(dāng)細(xì)菌死亡溶解或用人工方法破壞后才釋放出來。

（1）特征：

內(nèi)毒素非常耐熱，只有在160℃，加熱2-4h，或者用強(qiáng)堿/強(qiáng)酸/強(qiáng)氧化劑加熱煮沸30min才能破壞其生物活性。

 

（2）污染源：

①配制各種試劑、緩沖液的水

②各種培養(yǎng)基、血清和添加劑中“混入”

③塑料器具、玻璃器具等表面

 

（3）對(duì)細(xì)胞的影響：

①細(xì)胞功能改變：內(nèi)毒素可以刺激一些細(xì)胞分泌炎癥因子，導(dǎo)致局部炎癥反應(yīng)，如低至 0.5 ng/mL 的內(nèi)毒素處理6h就可以增加馬腹膜巨噬細(xì)胞中IL-6的分泌[6]；

②導(dǎo)致細(xì)胞亞健康： 內(nèi)毒素會(huì)加速細(xì)胞衰老、凋亡，甚至死亡；

③活化細(xì)胞：在單核細(xì)胞存在的條件下，100 ng/mL內(nèi)毒素可以刺激人類T細(xì)胞的增殖及其淋巴因子的產(chǎn)生[7]；

④降低真核細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染效率：已純化質(zhì)粒 DNA 中的內(nèi)毒素可降低所有細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染效率和活力，內(nèi)毒素含量（> 10 EU/μg）會(huì)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)染、蛋白質(zhì)表達(dá)和活力產(chǎn)生負(fù)面影響[8]。

 

（4）內(nèi)毒素的預(yù)防：

①選擇高質(zhì)量/低內(nèi)毒素的培養(yǎng)基、血清和試劑耗材，在免疫細(xì)胞的培養(yǎng)過程中，可以選擇免疫細(xì)胞專用的無(wú)血清培養(yǎng)基，如果選擇經(jīng)典的培養(yǎng)體系，要選擇低內(nèi)毒素的血清和基礎(chǔ)培養(yǎng)基；同時(shí)，免疫細(xì)胞培養(yǎng)的過程中添加的生長(zhǎng)因子等也要選擇高質(zhì)量低內(nèi)毒素的；

②重復(fù)使用的實(shí)驗(yàn)耗材可高溫高壓處理：250℃，30分鐘，或者180℃，3小時(shí)；

③細(xì)胞培養(yǎng)的水質(zhì)也至關(guān)重要，賽多利斯的mini純水儀可以滿足實(shí)驗(yàn)室每日15ml純水/超純水的用量，關(guān)愛每一個(gè)細(xì)胞寶寶；

④另外可以對(duì)培養(yǎng)過程中自行配置的一些緩沖液進(jìn)行過濾除菌，這樣可以在加入到細(xì)胞之前消除潛在的內(nèi)毒素。

 

（5）內(nèi)毒素的檢測(cè)：

小優(yōu)也給大家整理了內(nèi)毒素每種檢測(cè)方法的原理、優(yōu)缺點(diǎn)（表6）。常用的方法是鱟試劑法和重組 C因子法，由于鱟作為國(guó)家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物，目前不能再進(jìn)行大規(guī)模使用。所以我們推薦大家使用重組 C因子(rFC) 法來檢測(cè)內(nèi)毒素。

 

表6 內(nèi)毒素的檢測(cè)方法

 

（6）內(nèi)毒素的清除：

細(xì)胞培養(yǎng)中的內(nèi)毒素暫時(shí)沒有方法可以有效去除，所以小優(yōu)建議大家做好預(yù)防，畢竟防大于治！

 

參考文獻(xiàn)：

1.Netto, Cristiane et al. [publication of the Brazilian Society for Microbiology] vol. 45,4 1513-9. 4 Mar. 2015

2.Logunov, D Y et al Oncogene vol. 27,33 (2008): 4521-31.

3.Benedetti, Francesca et al. “Mycoplasmas-Host Interaction: Mechanisms of Inflammation and Association with Cellular Transformation.” Microorganisms vol. 8,9 1351. 4 Sep. 2020

4.Yin, Zi-Fei et al. “Mycoplasma contamination-mediated attenuation of plasmid DNA transfection efficiency is augmented via L-arginine deprivation in HEK-293 cells.” Journal of Zhejiang University. Science. B vol. 20,12 (2019): 1021-1026

5.Li, Peng et al. “Mechanism of Apoptosis Induction by Mycoplasmal Nuclease MGA-0676 in Chicken Embryo Fibroblasts.” Frontiers in cellular and infection microbiology vol. 8 105. 4 Apr. 2018

6.Morris,D.D., Crowe, N., Moore, J.N.and Moldawer, L.L. Endotoxin-Induced Production ofInterleukin 6 by Equine Peritoneal Macrophages In Vitro. Am. J. Vet. Res.53:1298-1301 (1992

7.Mattern, T.,Thanhauser, A., Reiling, N.,Toellner, K., Duchrow, M., Kusumoto, S.,Rietschel,E.T., Ernst, M., Brade, H.,Flad, H.D. and Ulmer, A.J. Endotoxin and Lipid A StimulateProliferation of Human T Cells In the Presence of Autologous Monocytes. J.Immunol. 153:2996-3004(1994)

8.Butash, KA et al.(2000) Reexamination of the Effect of Endotoxin on Cell Proliferation and Transfection Efficiency.Biotechniques 29(3): 610-614, 616, 618-619