Co-IP 實(shí)驗(yàn)不踩坑：蛋白

在蛋白生物學(xué)的世界里，Co-IP 是解鎖蛋白質(zhì)“朋友圈”的神兵利器。但如果操作不當(dāng)，它可能會(huì)變成實(shí)驗(yàn)室里的“尷尬社交”。今天，我們就來(lái)聊聊如何讓你的 Co-IP 實(shí)驗(yàn)優(yōu)雅又高效，輕松把蛋白“拉下場(chǎng)”！

 

01
什么是 Co-IP？

免疫共沉淀 (Co-Inmunoprecipitation, Co-IP) 是一種利用目標(biāo)蛋白特異性抗體與蛋白 A/G 磁珠或瓊脂糖珠結(jié)合，從而沉淀目標(biāo)蛋白及其相互作用蛋白的技術(shù) [1-4]。

圖 1.  Co-IP 原理圖。

X：誘餌蛋白，Z：靶標(biāo)蛋白

簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，就是利用抗體捕捉目標(biāo)蛋白，看看有哪些其他蛋白會(huì)“搭順風(fēng)車”來(lái)到沉淀派對(duì)。這樣我們就可以知道哪些蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)是好朋友，經(jīng)常一起 Hang out！

Co-IP 優(yōu)勢(shì)
 

可沉淀誘餌蛋白在天然組織細(xì)胞狀態(tài)下存在互作關(guān)系的所有蛋白；

 

可沉淀整個(gè)復(fù)合體中直接/間接互作的多個(gè)蛋白，研究復(fù)合體組成；

 

可與質(zhì)譜鑒定連用可以初篩到一系列未知蛋白，再通過其他技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證；

 

分離得到天然狀態(tài)下相互作用的蛋白質(zhì)復(fù)合體，結(jié)果更真實(shí)可靠。

Co-IP 分類

根據(jù)抗體來(lái)源、靶蛋白表達(dá)方式及樣本類型等差異，Co-IP 可分為單克隆抗體/多克隆抗體 Co-IP、內(nèi)源性/外源性 Co-IP、探索型/驗(yàn)證型 Co-IP 等類型。

在眾多 Co-IP 分類方式中，內(nèi)源性和外源性 Co-IP 就像科研界的雙子星，不僅最常用，還各自閃耀獨(dú)特的光芒！

 

 

 小貼士：

 

內(nèi)源性 Co-IP：研究細(xì)胞或組織中自然表達(dá)的蛋白質(zhì)。

外源性 Co-IP：研究經(jīng)過轉(zhuǎn)染介導(dǎo)的外源表達(dá)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)的蛋白質(zhì)。

 

 

02
 操作步驟與結(jié)果分析

Co-IP 實(shí)驗(yàn)流程

圖 2. Co-IP 實(shí)驗(yàn)流程圖[1][5]。

Co-IP 流程 (以內(nèi)源性 Co-IP 為例)[1]


01
樣本準(zhǔn)備

采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ占��?xì)胞，使用含有合適的蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液裂解細(xì)胞。

02
固相介質(zhì)準(zhǔn)備

將含有保護(hù)液的蛋白 A/G 磁珠或蛋白 A/G 瓊脂糖混勻取出，用平衡液清洗磁珠/瓊脂糖凝膠。

03
預(yù)清洗 (可選)

將細(xì)胞裂解液或已預(yù)處理的樣本用蛋白 A/G 磁珠或蛋白 A/G 瓊脂糖進(jìn)行預(yù)清洗，去除非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。

04
免疫沉淀

預(yù)清洗的樣本中加入誘餌蛋白的特異性抗體，孵育促進(jìn)抗體與蛋白結(jié)合。加入蛋白 A/G 磁珠或蛋白 A/G 瓊脂糖繼續(xù)孵育使其與復(fù)合物結(jié)合。

05
洗滌

洗滌復(fù)合物，去除非特異性結(jié)合蛋白。

06
洗脫

加入洗脫緩沖液，洗脫。

07
分析

Western Blot 或質(zhì)譜檢測(cè)分析沉淀的誘餌蛋白及與其結(jié)合的靶標(biāo)蛋白。

 

 

 小貼士：

內(nèi)源性 Co-IP 實(shí)驗(yàn)可選擇蛋白 A/G 磁珠或蛋白 A/G 瓊脂糖；外源性 Co-IP 實(shí)驗(yàn)中蛋白攜帶標(biāo)簽 (如 Flag、HA、c-Myc、GST 等)，可以選擇標(biāo)簽抗體類磁珠/瓊脂糖凝膠珠 (如 Anti-Flag 磁珠、Anti-HA 磁珠、Anti-c-Myc 磁珠、Anti-GST 磁珠等)，可一定程度增強(qiáng)豐度，減少 IgG 干擾。
 

 

Co-IP 結(jié)果解讀

隨著 Co-IP 實(shí)驗(yàn)流程的完成，我們終于手握初步數(shù)據(jù)！那么，這些數(shù)據(jù)能告訴我們什么秘密？結(jié)果出來(lái)了，腫么分析呢？

以下讓小 M 通過兩個(gè)經(jīng)典案例，來(lái)看看如何解讀實(shí)驗(yàn)結(jié)果，挖掘蛋白質(zhì)相互作用的“朋友圈”！

內(nèi)源性 Co-IP 結(jié)果解讀

圖 3. 內(nèi)源性 ANT2 和 GRP75之間存在相互作用[6]。

 

外源性 Co-IP 結(jié)果解讀

圖 4. 外源 GRP75 可增強(qiáng) ANT2-UCP1 的相互作用[6]。

 

03
避坑指南：如何高效無(wú)誤地進(jìn)行 Co-IP?

樣品準(zhǔn)備：打好地基

拉蛋白就是請(qǐng)客吃飯，不給它們舒適的環(huán)境，誰(shuí)都不愿來(lái)！ 

關(guān)注點(diǎn)	說(shuō)明
裂解液	溫和的非離子型洗滌劑 (如 NP-40、Triton X-100) 可以保護(hù)蛋白的天然結(jié)構(gòu)，同時(shí)避免過強(qiáng)的去污劑 (如 SDS) 破壞蛋白相互作用。 MCE 裂解液推薦：WB/IP 裂解液、NP-40 裂解液、哺乳動(dòng)物活性蛋白抽提試劑。
鹽濃度	樣品準(zhǔn)備時(shí)體系中的鹽濃度范圍在 150 - 300 mM 即可，過高可能“拆散”蛋白關(guān)系，過低可能導(dǎo)致背景蛋白“攪局”。
蛋白酶抑制劑	適當(dāng)加入蛋白酶抑制劑，保護(hù)“核心成員”防止其被細(xì)胞內(nèi)源性蛋白酶降解。 MCE 蛋白酶抑制劑推薦：蛋白酶抑制劑 Cocktail、蛋白酶抑制劑 Cocktail, 片劑。
結(jié)構(gòu)干擾	提前查閱文獻(xiàn)了解蛋白“愛好”，重視蛋白修飾，如磷酸化、乙�；�等是否會(huì)影響復(fù)合物的穩(wěn)定性。
表達(dá)水平	提前驗(yàn)證目標(biāo)蛋白表達(dá)水平，表達(dá)低可考慮優(yōu)化轉(zhuǎn)染或表達(dá)條件。
溫度	低溫環(huán)境下制備樣品，防止蛋白“跑路”。

 

抗體選擇：定向輸出

抗體選不好，后果你懂的……

無(wú)論是拉下目標(biāo)蛋白還是背景干擾，抗體都能“一錘定音”。 

關(guān)注點(diǎn)	說(shuō)明
抗體專一性	選擇經(jīng)過 IP 驗(yàn)證的抗體，不可盲選。 MCE 標(biāo)簽抗體：DYKDDDDK Tag (FLAG) 抗體、HA tag 抗體 (YA856)、Myc-tag 抗體。
同型對(duì)照	根據(jù) IP 抗體類型選擇合適的同型對(duì)照抗體。 MCE 同型對(duì)照抗體推薦：Rabbit IgG Isotype Control、Mouse IgG Isotype Control。
抗體來(lái)源	一抗和二抗的宿主種屬要避開“同宗”，否則背景會(huì)搶戲。
抗體測(cè)試	必要時(shí)進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)封閉抗體測(cè)試，驗(yàn)證磁珠/瓊脂糖珠可與抗體有效結(jié)合。
抗體用量	太多可能造成非特異性沉淀，太少又可能拉不住目標(biāo)蛋白。建議從優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中找到合適的濃度和用量。
二抗選擇	如果抗體重鏈和目標(biāo)蛋白大小相近，可選擇輕鏈特異性二抗避免“撞車”。

 

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：精準(zhǔn)操作

Co-IP 實(shí)驗(yàn)不止“拉下”，其他環(huán)節(jié)也是“硬仗”。

實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)	說(shuō)明
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)	確定研究的蛋白質(zhì)對(duì)，不胡亂邀請(qǐng)“不相干”的蛋白。
對(duì)照組設(shè)計(jì)	實(shí)驗(yàn)組、IgG 陰性組、陽(yáng)性組 (Input)。
洗滌條件	適當(dāng)調(diào)整洗滌強(qiáng)度 (如低鹽到高鹽、去垢劑濃度等)，既要去除非特異性蛋白，又要保護(hù)靶蛋白復(fù)合物。
Western Blot	用 Western Blot來(lái)做最后的“身份確認(rèn)”，確保邀請(qǐng)到的都是真正的“貴賓”。

    

 

04
經(jīng)典問題和解決方案

如何讓你的 Co-IP 實(shí)驗(yàn)更上一層樓？

每次實(shí)驗(yàn)的具體條件、操作步驟記得詳細(xì)記錄，這樣才能在出現(xiàn)問題時(shí)找到原因，不斷優(yōu)化喔~

 

 

 

05
小結(jié)

每一個(gè) Co-IP 實(shí)驗(yàn)都是一場(chǎng)精彩的偵探游戲，我們不僅是執(zhí)行者，更是策略家。這就是科研人的浪漫——在實(shí)驗(yàn)中找尋未知的興奮，用結(jié)果揭示生命的奧秘。

如果你覺得這篇干貨滿滿的 Co-IP 秘籍有幫助，別忘了點(diǎn)贊、分享哦！期待在評(píng)論區(qū)看到你們的精彩討論和寶貴經(jīng)驗(yàn)！我們下期再見，繼續(xù)解鎖更多實(shí)驗(yàn)技巧，讓科研不再有坑，只有驚喜！

 

產(chǎn)品推薦

Anti-HA Magnetic Beads (HY-K0201) HA 標(biāo)簽蛋白 IP，外源性 Co-IP 實(shí)驗(yàn)

Protein A/G Magnetic Beads (HY-K0202) IP、內(nèi)源性 Co-IP 實(shí)驗(yàn)

Anti-Flag Magnetic Beads (HY-K0207) Flag 標(biāo)簽蛋白 IP，外源性 Co-IP 實(shí)驗(yàn)

Magnetic Stand (HY-K0200) 磁性分離裝置

Rabbit IgG Isotype Control (HY-P80879) 兔 IgG 陰性對(duì)照

Mouse IgG Isotype Control (HY-P80757) 鼠 IgG 陰性對(duì)照

參考文獻(xiàn)
[1] Lin JS, et al. Protein-Protein Interactions: Co-Immunoprecipitation. Methods Mol Biol. 2017;1615:211-219.

[2] Tan L, Yammani RR. Co-Immunoprecipitation-Blotting: Analysis of Protein-Protein Interactions. Methods Mol Biol. 2022;2413:145-154.
[3] Lee C. Coimmunoprecipitation assay. Methods Mol Biol. 2007;362:401-6.
[4] Tang Z, et al. Analysis of Protein-Protein Interaction by Co-IP in Human Cells. Methods Mol Biol. 2018;1794:289-296.
[5] Burckhardt CJ, Minna JD, Danuser G. Co-immunoprecipitation and semi-quantitative immunoblotting for the analysis of protein-protein interactions. STAR Protoc. 2021 Jul 6;2(3):100644.
[6] Chen X, et al. GRP75 triggers white adipose tissue browning to promote cancer-associated cachexia. Signal Transduct Target Ther. 2024 Sep 26;9(1):253.