ACSL4與多不飽和脂質(zhì)與癌細胞轉(zhuǎn)移的相關性

腫瘤轉(zhuǎn)移是指癌細胞從原發(fā)部位通過不同途徑轉(zhuǎn)移到身體其它組織器官，并形成新的病灶的過程。腫瘤轉(zhuǎn)移是大多數(shù)癌癥相關死亡的主要原因。在卵巢癌病例中，循環(huán)癌細胞首先從血流、淋巴血管或腹膜液中的流體環(huán)境中滲出，到達遠端器官。由于高機械應力等原因，轉(zhuǎn)移性外滲是一個低效的過程，只有一小部分癌細胞成功侵入目標組織實質(zhì)。然而，作為細胞最基本的、組成成分的脂質(zhì)在支持癌細胞外滲的特性仍然知之甚少。

2024年11月，西湖大學鄒貽龍、王曦團隊合作，在國際頂尖學術期刊 Cell 上發(fā)表了題為：ACSL4 and polyunsaturated lipids support metastatic extravasation and colonization 的研究論文。該研究揭示了多種癌癥的轉(zhuǎn)移潛能和鐵死亡易感性之間的相關性，轉(zhuǎn)移的癌細胞具有更高的鐵死亡敏感性和多不飽和脂肪酸脂質(zhì)（PUFA-Lipid）含量。長鏈酯酰輔酶A合成酶(long-chain acyl-CoA synthetase, ACSLs)屬于多基因家族編碼的酶，是機體內(nèi)脂肪代謝的關鍵酶，主要催化12~20個碳鏈長度的脂肪酸,三磷酸腺苷和輔酶A形成長鏈�；�輔酶A。ACSL4是ACSL家族中的一員,參與對花生四烯酸和二十碳五烯酸的調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)ACSL4通過增強膜流動性和細胞侵襲性促進轉(zhuǎn)移性外滲，還通過促進多不飽和脂肪酸（PUFA）向�；�輔酶A（acyl-CoA）的酯化發(fā)揮促進鐵死亡的作用。該研究還發(fā)現(xiàn)，多不飽和脂肪酸脂質(zhì)在促轉(zhuǎn)移的同時，依賴ECH1等限速酶，共抑制ACSL4和ECH1，可有效抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。這項研究不僅揭示了癌癥轉(zhuǎn)移的新機制，還為開發(fā)靶向腫瘤轉(zhuǎn)移的新型藥物奠定了基礎。

技術路線圖

1. 腫瘤轉(zhuǎn)移潛能與鐵死亡敏感性之間的相關性

利用 MetMap 數(shù)據(jù)庫和 CTRP 數(shù)據(jù)庫來評估癌細胞系的轉(zhuǎn)移潛能及其對鐵死亡誘導劑的敏感性之間的關系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)具有高轉(zhuǎn)移潛能的卵巢癌、肝癌和頭頸癌細胞系對鐵死亡誘導劑更敏感。進一步利用臨床樣本分離原代癌細胞，通過體外實驗發(fā)現(xiàn)來自腹水或網(wǎng)膜的腫瘤細胞比原發(fā)腫瘤細胞對鐵死亡更敏感。隨后采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 (LC-MS/MS) 技術分析了卵巢癌細胞中的脂質(zhì)成分，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞中多不飽和脂肪酸（PUFA）顯著增加，表明脂質(zhì)代謝在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

圖1. 腫瘤轉(zhuǎn)移潛能與鐵死亡敏感性之間的相關性

2. 卵巢癌轉(zhuǎn)移模型構(gòu)建

從MetMap數(shù)據(jù)庫中篩選出了具有高轉(zhuǎn)移潛能和高鐵死亡敏感性的卵巢癌細胞系ES-2來構(gòu)建模型，進一步通過重復體內(nèi)篩選，從肝臟和肺組織中分離出具有高轉(zhuǎn)移能力的ES-2細胞克隆，命名為ES-2-MC1-Hep和ES-2-MC1-Lung。鐵死亡誘導劑處理之后發(fā)現(xiàn)，兩種細胞對誘導劑的敏感性更高。脂質(zhì)組學的研究進一步發(fā)現(xiàn)，ES-2-MC1-Lung細胞中PUFA含量升高，尤其是含有C20:4和C22:6側(cè)鏈的磷脂酰乙醇胺(PEs)。

3. 構(gòu)建體內(nèi)基因篩選模型

通過兩輪體內(nèi)篩選，從小鼠肝臟中篩選出具有高轉(zhuǎn)移效率的ES-2-MC2-Hep細胞。利用靶向288個磷酸酶的CRISPR sgRNA文庫進行了遺傳篩選，成功地識別了多個候選的肺臟轉(zhuǎn)移抑制基因(PTPRG和PTPN3)和促進基因(PPA1和PPP2R1A)。

圖2. 構(gòu)建卵巢癌高效轉(zhuǎn)移模型

4. NMNAT1和ACSL4是調(diào)控卵巢癌轉(zhuǎn)移的關鍵基因

通過體內(nèi)CRISPR篩選，發(fā)現(xiàn)NMNAT1、HADHB、PTPRG和ATP6V1H與肝臟和肺轉(zhuǎn)移相關。其中NMNAT1介導NAD生物合成并參與各種原發(fā)癌癥的進展，敲除NMNAT1可以抑制卵巢癌肝臟和肺轉(zhuǎn)移。隨后又利用CRISPR-Cas9技術敲除和回補實驗發(fā)現(xiàn)，ACSL4參與脂肪酸代謝，敲除 ACSL4 可以抑制卵巢癌肺轉(zhuǎn)移。

圖3. NMNAT1和ACSL4是調(diào)控卵巢癌轉(zhuǎn)移的關鍵基因

5. ACSL4促進癌細胞外滲

免疫熒光分析顯示，靜脈內(nèi)植入ES-2-MC2-HEP-sgACSL4細胞形成的轉(zhuǎn)移灶更少、更小。為了進一步闡明ACSL4的外滲作用，使用ACSL4藥理學抑制劑PRGL493對癌細胞進行預處理，并對荷瘤小鼠進行持續(xù)治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PRGL493治療可減輕肺實質(zhì)灌注后的癌細胞負荷，說明ACSL4在癌細胞轉(zhuǎn)移中的外溢出中起重要作用。接下來進一步研究發(fā)現(xiàn)敲除ACSL4可以降低細胞膜的流動性和細胞的侵襲能力。通過ARA（花生四烯酸）預處理，提高了ES-2-GFP-Luc親代細胞的PUFA脂質(zhì)含量，增加了靜脈植入后小鼠的腫瘤轉(zhuǎn)移外滲率。表明ACSL4和PUFA可能通過增強轉(zhuǎn)移性癌細胞的膜流動性和侵襲性促進轉(zhuǎn)移性外滲。

圖4. ACSL4促進癌細胞外滲

6. ACSL4的促轉(zhuǎn)移作用不僅僅局限于卵巢癌

除了卵巢癌細胞系 ES-2-MC2-Hep外，使用了肝癌細胞系SK-HEP-1和乳腺癌細胞系4T1也進行了體內(nèi)CRISPR篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ACSL4是促進肺轉(zhuǎn)移的最重要靶點基因之一，且敲除ACSL4可以抑制SK-HEP-1細胞的肺轉(zhuǎn)移。通過ARA提高細胞中的多不飽和脂肪酸水平可以促進SK-HEP-1和4T1細胞的肺轉(zhuǎn)移。說明ACSL4在其他癌癥轉(zhuǎn)移過程中或具有功能普適性。

圖5. ACSL4的促轉(zhuǎn)移作用不僅僅局限于卵巢癌

7. 富含不飽和脂質(zhì)的癌細胞依靠ECI1/ECH1在體內(nèi)生長

通過體內(nèi)CRISPR篩選，篩選出6個在皮下腫瘤、肝轉(zhuǎn)移瘤和肺轉(zhuǎn)移瘤中都顯著減少的sgRNA，它們靶向的基因包括MDH1、ABHD6、ECH1、ECI1、ATP5E和B3GNT4。進一步敲除ABHD6、ECI1、ECH1或MDH1可以抑制卵巢癌細胞系ES-2-MC2-Hep和腎癌細胞系769-P的皮下腫瘤生長。為了評估ECI1和ECH1這兩種在UFAs（不飽和脂肪酸）預降解過程中所特有的酶是否確實是脂肪酸β氧化所必需的，進行了Seahorse分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲除ECI1或ECH1可以抑制ES-2-MC2-Hep細胞對ARA的呼吸利用。利用公共數(shù)據(jù)TCGA數(shù)據(jù)集發(fā)現(xiàn)，ABHD6、ECI1、ECH1和MDH1 mRNA的高表達水平與卵巢癌患者的預后不良相關，這表明UFA  β-氧化途徑的促腫瘤作用可能與人類癌癥有關。

圖6. 富含不飽和脂質(zhì)的癌細胞依靠ECI1/ECH1在體內(nèi)生長

8. 雙重抑制ACSL4和ECH1抑制腫瘤轉(zhuǎn)移

利用CRISPR-Cas9技術敲除ACSL4和ECH1基因，構(gòu)建雙敲除 (DKO) ES-2-MC2-Hep細胞系，發(fā)現(xiàn)靜脈植入DKO細胞與ACSL4或ECH1單缺失的細胞相比，在注射后21天的肺轉(zhuǎn)移負荷更低。并且在敲除ACSL4的ES-2-MC2-Hep細胞中ECH1蛋白升高。在黑色素瘤細胞B16-F10細胞中，ACSL4/ECH1的DKO可以抑制肺轉(zhuǎn)移，表明聯(lián)合靶向UFA的酯化和β-氧化可能是治療轉(zhuǎn)移性腫瘤的有效策略。

圖7. 雙重抑制ACSL4和ECH1抑制腫瘤轉(zhuǎn)移

小結(jié)

控制轉(zhuǎn)移是癌癥治療中一個持續(xù)的挑戰(zhàn)，本研究揭示了癌細胞轉(zhuǎn)移潛力與鐵死亡敏感性之間的相關性，通過在小鼠模型中進行的代謝聚焦CRISPR篩選，發(fā)現(xiàn)ACSL4是促進血液轉(zhuǎn)移的關鍵因素，其通過增強膜流動性和細胞侵襲性來促進癌細胞的外滲。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，富含PUFA的癌細胞在體內(nèi)生長時依賴于ECI1/ECH1進行β-氧化。這些發(fā)現(xiàn)為未來的治療干預提供了新的靶點，有望改善轉(zhuǎn)移性癌癥患者的預后。

參考文獻

ACSL4 and polyunsaturated lipids support metastatic extravasation and colonization. Cell. 2024.

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