激光共聚焦技術與非損傷微測技術結合的優(yōu)勢

2008年諾貝爾化學獎授予三位發(fā)現熒光蛋白的科學家，表彰他們對生命科學發(fā)展的重要貢獻。熒光技術是現代生命科學研究中非常重要的技術，也是目前檢測生物體樣品內離子分子狀態(tài)的最佳手段。激光共聚焦技術的出現，使熒光技術如虎添翼。通過共聚焦顯微鏡和飛秒紅外激光器等部件的配合使用，不僅可以得到非常清晰的熒光圖像，進行多重熒光標記的定位和定量分析，還具有圖像三維重建、熒光共振能量轉移譜測定甚至膜電位測定等功能，成為生命科學研究的重要技術手段。近年來，應用激光共聚焦技術發(fā)表的高水平研究成果越來越多，受到生命科學家的廣泛關注。

但隨著激光共聚焦技術應用范圍的擴大，其在研究中的局限性也突顯出來。激光共聚焦技術可以視為對熒光技術的重大改進，但并未對熒光技術作出本質改變，因而熒光技術的固有缺陷也在激光共聚焦技術上體現出來。首先，激光共聚焦技術主要獲得的是生物樣品內部的離子分子信息，這些離子分子信息的改變既可能源于樣品內部離子分子源的變化，也可能源于樣品內外的離子分子交換。這兩種離子分子變化過程是由完全不同的生命機制引發(fā)的。盡管激光共聚焦技術也可以測量生物樣品外部的離子分子信息，但存在許多問題影響測量的準確性。這導致共聚焦數據的重大缺陷，必須通過大量的后續(xù)實驗才能得出比較準確的結論。若單純用激光共聚焦數據作為檢測或診斷標準，往往面臨很大的假陽性風險。其次，激光共聚焦測量時必須向生物樣品內導入熒光物質，不僅操作過程復雜，而且這些熒光物質對樣品活性有已知或潛在的影響，甚至可能導致樣品生理狀態(tài)改變，造成數據失真。這些問題已經成為激光共聚焦技術發(fā)展的瓶頸，嚴重制約了它的進一步應用。

為克服現有激光共聚焦技術存在的問題，必須使激光共聚焦技術能夠同時準確獲得被測樣品內外的離子分子信息并盡量減輕測試過程中對樣品的損傷。現有的激光共聚焦技術體系要實現這兩點非常困難，而激光共聚焦技術與非損傷微測技術的結合卻可以輕松做到。

非損傷微測技術是一大類選擇性/特異性微電極技術的總稱。1990年，非損傷微測技術誕生于產生過多為諾貝爾獎獲得者的美國MBL實驗室（2008年諾貝爾化學獎得主之一下村修曾在該實驗室工作多年）。與其他侵入式測量技術最大的區(qū)別在于，非損傷微測技術測試過程由電腦自動控制微電極運動，非常接近樣品表面而不接觸樣品進行測量，獲得樣品外環(huán)境的離子分子的絕對濃度、流動速率和流動方向的信息。非損傷性測量是非損傷微測技術的重要特色，測試在與生物樣品真實生存環(huán)境相似的液體中進行，不導入任何外源物質，最大程度保證了樣品的生物活性和生理狀態(tài)。也正由于測試過程中微電極不需要接觸樣品，使得非損傷微測技術被測樣品范圍非常廣泛，從動植物整體、器官、組織、細胞聚集體、單個細胞到富集的細胞器均可。而獲得離子分子的流動速率和流動方向則是非損傷微測技術的鮮明優(yōu)勢，也是其他技術手段難以獲得的重要信息。與濃度反映的離子分子靜態(tài)信息相比，流動速率和流動方向反映的則是離子分子動態(tài)信息，樣品外環(huán)境的離子分子流動速率和流動方向實質上表征的是樣品內外離子分子的交換情況，更能反映生命活動過程的本質。除此之外，非損傷微測技術還具有多電極、長時間、多角度測量等特色。

正因為非損傷微測技術的上述優(yōu)勢和特色，自誕生以來便獲得了越來越廣泛的應用，迄今已在《Science》、《Nature》等國際著名雜志發(fā)表論文百余篇。非損傷微測技術所獲取數據和激光共聚焦技術獲取的數據有很大互補性，兩者結合可以同時準確檢測樣品內外離子分子的變化情況，提供生命活動過程的完整信息，明確生命活動機制機理。非損傷微測技術可以測量生命活動中常見的五十多種離子和分子，覆蓋了激光共聚焦技術的檢測范圍。而非損傷微測技術在測量時也需要配備顯微鏡，這使非損傷微測技術和激光共聚焦技術的結合有了硬件基礎。

早在2001年，葡萄牙學者在《Nature Cell Biology》發(fā)表研究論文，應用非損傷微測技術和激光共聚焦技術同時檢測卵細胞與配子融合過程中卵細胞內外Ca²⁺的變化情況。非損傷微測技術檢測發(fā)現，在融合一瞬間，胞外Ca²⁺有一個非常明顯的內流，而此時激光共聚焦技術發(fā)現胞內Ca²⁺顯著增加，如下圖所示。這充分說明卵細胞和配子融合過程中胞內Ca²⁺的增加源于對胞外Ca²⁺的吸收而非內源Ca²⁺釋放，解決了長期懸而未決的科學難題。

非損傷微測技術與激光共聚焦技術同時測量細胞內外Ca²⁺

上述實例是非損傷微測技術和激光共聚焦技術結合的濫觴。非損傷微測技術和激光共聚焦技術的結合瞄準當今生命科學界以揭示生命活動機理和功能為主要研究內容的潮流，全面反映生命活動的信息，所產出數據有很強的說服力，易于產生高水平研究成果。